作者：李容林 ，李春阳，张伟 作者单位：中山大学 1. 光华口腔医学院·附属口腔医院; 2. 中山医学院组织学胚胎学教研室， 广东 广州 510080

　　【摘要】 【目的】探讨含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架对人牙周膜细胞(HPDLC)生长和增殖的影响。【方法】 MTT法观察含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液、不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液以及正常细胞培养液对HPDLC生长和增殖的影响，利用流式细胞仪(FCM)检测上述3种液体对HPDLC细胞周期的影响，并将HPDLC接种于含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架和不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内，通过免疫细胞组织化学和激光共聚焦显微镜来检测HPDLC在复合支架内的存活和增殖情况。【结果】 含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液对HPDLC生长和增殖的促进作用明显强于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液和正常细胞培养液，而后两组间无统计学意义;含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液促进HPDLC从G1期进入S期;HPDLC在含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内的生长和增殖也明显优于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架。【结论】 含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架可以促进体外培养的HPDLC生长和增殖。

　　【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子; 壳聚糖; Ⅰ型胶原; 复合支架; 牙周膜细胞

　　牙周组织缺损的修复主要针对牙周韧带、牙骨质和牙槽骨,目前利用组织工程材料修复牙周组织缺损的研究很多[1-3]。组织工程的三大基本要素是种子细胞、可降解的支架材料与细胞生长调节因子。当前组织工程化组织的构建方式有3种:①支架材料+种子细胞;②支架材料+生长因子;③支架材料+种子细胞+生长因子。本课题组在先期研究壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架材料的基础上[4],将人牙周膜细胞 (human periodontal ligament cells, HPDLC)接种于含碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor， bFGF)的壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内，观察细胞的生长和增殖情况，从而探讨这种新型复合支架用于牙周引导性组织再生的可行性。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料、试剂和设备

　　壳聚糖(Sigma，脱乙酰度85%)，Ⅰ型胶原(广州创尔生物技术有限公司), DMEM(Sigma)，胎牛血清(FBS, Gibco)，胰蛋白酶(Trypsin, Ameresco)，波形丝蛋白(Vimentin, Sigma)，角蛋白(Keratin, 博士德)，SABC-FITC免疫组化试剂盒(博士德)， SAN YOMDF2192A T 型超低温保存箱(日本)，Unicryo MC2L -60℃冷冻干燥机(德国)，HITACHI S-3000N 扫描电镜(日本)，激光共聚焦显微镜(德国蔡司)。

　　1.2 壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架的制备

　　室温下将壳聚糖溶于0.2 mol/L乙酸并搅拌均匀，配成20 g/L的壳聚糖溶液，Ⅰ型胶原以同等浓度乙酸配成4.6 g/L的胶原溶液，0.22 μm滤器过滤除菌，壳聚糖、Ⅰ型胶原按体积比1 ∶ 1混合，一组加入bFGF(10 ng/mL)为A组，另一组为B组，加入同等量的DMEM，搅拌均匀后离心除渣脱泡。将溶液倾入预冷的24孔板中在-20 ℃下冻存24 h，后移入冻干机冻干24 h，密封4 ℃保存。

　　1.3 壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架扫描电镜和孔径大小、孔隙率的测定

　　取以上支架材料，浸入液氮后折断，分别对其表面和内部结构喷铂金处理，扫描电子显微镜下加速电压20 kV , 放大不同倍数观察，并在材料内部选取5 个高倍视野(100倍)，每视野测量10 个孔径值，计算材料的平均孔径。采用液体位移法测定支架的孔隙率[5]。将支架样本切成5 mm×5 mm大小，置入体积为V1的无水乙醇中，5 min后负压吸引脱气，使乙醇充分进入多孔支架的孔隙中，直至再无气泡逸出，此时乙醇体积(浸没支架)计为V2。轻轻将浸满乙醇的支架样品取出，剩余乙醇体积计为V3。支架的孔隙率如下计算：e=(V1-V3)/(V2-V3)，每个样本测5 次，取其均值。

　　1.4 HPDLC的体外培养和鉴定

　　参照Inoue培养方法[6]，取因正畸需要拔除的新鲜第一前磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，剪成1 mm3碎块，以含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，在饱和湿度、5% CO2、37 ℃条件下细胞培养箱中孵育，细胞快长满培养瓶底时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，取第4或5代细胞用于实验。消化第5代HPDLCs，接种于六孔板中的盖玻片上，培养3 d后用40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，正常山羊血清室温封闭20 min，滴加一抗(小鼠抗人波形丝蛋白(1 ∶ 500)，小鼠抗人角蛋白(1 ∶ 200)于4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗涤3次，加抗小鼠IgG-FITC荧光二抗，37 ℃避光孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，加Hoechest 33342室温孵育20 min标记细胞核，0.01 mol/L PBS洗涤3次后荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察。

　　1.5 MTT法和流式细胞仪检测

　　将复合支架A(含bFGF)和复合支架B(不含bFGF)按3 cm2/mL (材料/培养液)的比例置含FBS的DMEM培养液中，37 ℃浸泡72 h，收集浸出液用于培养HPDLC。取生长良好的第5代HPDLC，调整细胞密度为1×105/mL接种细胞于96孔板，每孔100 μL。在饱和湿度、5%CO2、37 ℃标准环境下培养细胞48 h，弃去培养液及未贴壁的HPDLC。细胞分为A、B和C3组(每组32孔)，分别加入浸出液A，浸出液B和含FBS的DMEM培养液，每孔200 μL。每组分为1、3、5和7 d4个时间点(每个时间点各8孔)，分别于接种后1、3、5、7 d弃去培养液，每孔加入0.01 mol/L PBS 100 μL、MTT (1 mg/mL)液20 μL，继续培养4 h后弃去液体，加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min后，用分光光度仪以490 nm波长光测每孔吸光度(A490)值，SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析。取浸出液A和浸出液B 加入生长良好的第5代HPDLCs培养瓶中，培养5 d后消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期，以正常培养的HPDLCs作为对照，重复三次，结果行单因素方差分析。

　　1.6 HPDLCs在复合支架的种植和存活检测

　　取生长良好的第5代HPDLC，以2.5 g/L胰蛋白酶消化、收集和离心，Hoechest 33342标记细胞1 h，洗涤、离心后以正常培养液将细胞稀释成1×105 /mL备用。先将复合支架A(含bFGF)和复合支架B(不含bFGF)修成5 mm × 5 mm × 5 mm大小置于培养皿中，然后滴加细胞悬浮液100 μL，培养箱中静置1 h后再缓慢加入培养液，液面刚刚浸没复合支架，在饱和湿度、5%CO2、37 ℃标准环境下培养细胞。分别于培养1、3、7和14 d后取出复合支架，恒温冰冻切片机切片，片厚50 μm，按上述方法作波形丝蛋白免疫荧光化学染色。激光共聚焦显微镜下扫描支架，高倍镜下随机取10个视野，计数每mm2细胞数，每组样本每个时间点各5个复合支架。结果行One way ANOVA 检验。

　　2 结 果

　　2.1 壳聚糖屏障膜的微观结构、孔隙率

　　冻干后制备的壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架呈白色海绵状，表面粗糙，内部呈海绵状多孔隙结构(图1)。复合支架A和复合支架B微观结构一致，内部孔径测量分别为(158±17)μm 和(150±18)μm，孔隙率分别为90.8%±0.5%和91.1%±0.5%，两种支架的孔隙率无统计学意义(P >0.05)。

　　2.2 HPDLC的体外培养和鉴定

　　原代培养3 d后可见人PDLCs从组织块中向四周爬出(图2A)，传代几次后可以得到纯度较高的人PDLC，细胞呈梭形或星形，胞突细长，放射状排列，胞体丰满，胞浆均匀，核圆形或卵圆形，为成纤维样细胞(图2B)。细胞波形丝蛋白染色阳性(图2C)，角蛋白染色阴性(图2D)，由此可证明其中胚层组织来源。

　　2.3 壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液对HPDLC 增殖和细胞周期的影响

　　通过MTT法检测细胞吸光度得知，在细胞培养第1天，正常培养组、复合支架A浸出液组和复合支架B浸出液组间无显著性差别，第3、5、7天，正常培养组、复合支架B浸出液组间仍然无显著性差别，但是复合支架A浸出液组细胞吸光度在各时间点都明显高于其他两组(表1)。经流式细胞仪测试三组细胞周期时相结果见表2，与正常培养组和浸出液B组相比，浸出液A组的G1期(DNA 合成前期)细胞所占百分比明显降低, 而S期(DNA 合成期)细胞所占百分比升高, 反映细胞增殖活力的增殖指数Prl 值(S + G2M))也明显升高。

　　2.4 含bFGF壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架促进人PDLC在其内的存活和增殖

　　通过激光共聚焦显微镜扫描计数发现，细胞种植入复合支架内后1 d，两种支架内细胞数目基本一致(图3，P >0.05)，可见分布于支架内的绿色细胞胞体和蓝色的细胞核(图4A，4D)。细胞种植入复合支架内后3 d，两种支架内细胞数目均明显减少，但是复合支架A内细胞存活数目明显高于复合支架B内的(图3，P< 0.01;图4B，4E)。细胞种植入复合支架内后7 d和14 d，细胞数目明显增加，但是，在每一时间点，复合支架A内的细胞数均明显高于复合支架B内的(图3，P< 0.01;图4C，4F)。