摘要：目的 从成体人牙周组织中分离培养牙周韧带干细胞,研究其矿化诱导的可行性。方法 选取10～15 岁的年轻患者因正畸拔除的健康牙齿,刮取根中1 /3 的牙周膜,采用组织块培养法得到牙周韧带细胞,待细胞达一定量后用有限元稀释法进行单细胞克隆,筛选牙周韧带干细胞(PDLSC) ,体外矿化诱导后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性，矿化结节形成等等方面进行检测。结果 在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性，能够形成矿化结节，向成骨细胞方向分化。结论 从成体人牙周组织中可分离培养出干细胞,在体外能有效增殖且保持低分化状态,具有作为骨组织工程种子细胞来源的可能,也为牙周组织工程的应用奠定了实验基础。
　　关键词：牙周韧带; 干细胞; 矿化
　　1. 引 言
　　成体干细胞是指存在于成年机体组织器官中的具有自我更新和多向分化潜能的细胞。现己发现多种成体组织中都存在着干细胞[1]，早在1987 年，McCulloch[2]即提出牙周韧带中可能存在有前体细胞，这些细胞可能源自骨髓基质，通过血管通道进入牙周韧带，定位于牙周韧带血管周围及骨韧带间隙。到2004 年，Seo BM等人[3] 成功的从人的阻生牙上分离出PDLSC，他们首先对其横向分化潜能和表型作了研究，证明它具有多向分化的干细胞特点，同时将细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA-TCP)粉混合植入免疫缺陷小鼠皮下，发现能够形成牙周韧带牙骨质复合体样结构，并首次提出了牙周干细胞的概念，表明了牙周韧带干细胞的潜能。
　　我们对牙周韧带干细胞进行分离、培养,并进行矿化。局部微环境对干细胞的增殖和分化起关键性作用。在体外，培养条件则成为调控细胞分化方向的关键，国内外研究均表明干细胞在体外诱导液的作用下能够多向分化[4, 5]。矿化液是骨髓基质干细胞体外诱导向成骨细胞分化的有效途径。对于牙周韧带干细胞矿化诱导前后的变化，是本实验将要探讨的问题。
　　2. 材料与方法
　　2.1 实验用品
　　2.1.1 主要试剂
　　细胞培养试剂、仪器、免疫细胞化学试剂盒同前。矿化液为含10%胎牛血清，10－6M地塞米松，50μg/ml α-抗坏血酸(ascorbic acid) (Amesco,USA)，10mM β-甘油磷酸钠(β-glycerophyosphate，β-GP) (Sigma,USA)的DMEM。BSP 抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠 ）；ALP 活性检测试剂盒（南京建成）；其余试剂均为分析纯。以正常牙周韧带细胞作为对照组。
　　2.1.2 实验用液的配制
　　β-甘油磷酸钠: 取2.16g 溶于10m1 三蒸水。配成1 mol/L(100 x)的贮备液浓度。0.2μm 滤膜过滤，分装，-20℃保存备用。地塞米松及其贮备液配制: 配成1 mol/L 的贮备液浓度。0.2μm 滤膜过滤，分装，-20℃保存备用。
　　2.2 方法
　　2.2.1 细胞培养和克隆分离
　　参照Seo的方法[3]，采用胶原酶和disPase酶联合消化法进行牙周韧带干细胞的原代培养。具体简述如下：组织块法：取临床上10-15 岁因正畸而拔除的无龋病和牙周病的前磨牙，刮取牙根中1/3 处的牙周膜，剪成1mm2 大小的组织块，均匀地铺于培养瓶底，加入1mlDMEM培养液， 孵育4 小时，待组织块贴牢瓶底后，轻轻翻转培养瓶，继续培养。每3 天换液一次，直至细胞从组织块周围游出、待细胞汇合后用0.25%胰蛋白酶消化。酶消化法：同上法取组织块，用3mg/ml的I型胶原酶和4mg/ml的Dispase酶在37oC消化lh，轻轻吹打离散单细胞团块， 100μm的细胞筛网过滤，800 r.p.m离心5 min，重悬，以1 x 105/ml的密度接种于细胞培养瓶中，置5%CO2、饱和湿度的37oC恒温孵箱中培养。72h后首次换液，以后每3天换液l次。每日在倒置显微镜下观察，待细胞生长达80%~90%汇合时，胰酶消化传代。细胞计数板计数细胞浓度，调整后以1-2 个细胞／孔的浓度接种于96 孔板，常规培养7-14 天，至出现细胞克隆（细胞数≥50 为判定标准）后胰酶消化，逐步分别扩大培养，常规传代或冻存。
　　2.2.2 矿化诱导和VonKossa 染色
　　制备第3 代人牙周韧带干细胞及牙周韧带细胞悬液，以1×106cells /ml 的密度接种于6孔板，矿化液连续培养14 天，中止培养，0.01M 冷PBS 冲洗三遍，4%中性福尔马林固定后进行Von Kossa 染色，观察矿化结节形成情况，步骤依次为：5%硝酸银染色，紫外灯下照射10~15 min，去离子水洗20 min，5%亚硫酸钠还原1 min，1%中性红衬染，常规脱水封片，光镜观察。
　　2.2.3 碱性磷酸酶（ALP）活性检测
　　将两种细胞接种于24 孔板，矿化液连续培养14 天，弃去矿化液，0.01M 冷PBS 冲洗三遍，每孔加入细胞裂解液200μl，室温振荡10min，收集上清液，检测细胞的ALP 活性。用Lawry 法测蛋白含量，结果以ALP 活性/每克蛋白表示。
　　2.2.4 免疫组化检测骨唾蛋白表达
　　将两种细胞接种于6 孔板，矿化液连续培养14 天，中止培养，4%中性福尔马林固定后常规免疫组化检测骨唾蛋白表达。
　　3. 结果
　　3.1 矿化结节染色结果
　　克隆来源细胞用矿化液连续培养 14 天后，肉眼观可见白色点状物，倒置显微镜下细胞呈复层生长，局部形成白色的矿化结节，Von Kossa 染色显示其染成褐红色的大小不等的矿化结节，周边细胞界限不清，中央区为红黑色，周围逐渐变浅。对照组细胞虽然形成细胞结节，但Von Kossa 染色阴性。
　　3.2 ALP 活性检测结果
　　细胞经14 天矿化液诱导培养后，其ALP 活性与矿化结节的形成能力一致。t 检验结果表明克隆来源细胞的ALP 活性明显高于对照组细胞（P<0.05）。
　　3.3 免疫细胞化学检测结果
　　诱导前细胞抗BSP 染色为阴性，诱导后抗BSP 染色呈阳性，对照组诱导后抗BSP 染色呈阴性。
　　4. 讨论
　　牙周组织中包含着两种矿化组织[6]：骨和牙骨质，尽管这两种硬组织的矿化机制及矿化程度不尽相同，但它们的基本成分十分类似。两者的矿化成分都主要为羟基磷灰石和无定型磷酸钙，而矿化基质大部分为I型胶原和少量的非胶原蛋白。两者的非胶原蛋白成分也大体相同，主要有骨钙素(osteocalcin OCN)、骨桥素(osteopontin OPN)、及骨睡液蛋白(bonesialoprotein BSP)等。同时，形成两种矿化组织的成牙骨质细胞和成骨细胞也有相似之处，不仅都具有体外矿化的能力，对不同信号因子的反应也极为类似。因此，区别两种细胞具有一定难度。
　　骨唾蛋白(Bone sialoprotein)是一种高度糖基化和硫酸化的磷蛋白,是骨基质的主要非胶原蛋白之一，是矿化组织特异性蛋白[7]，虽然在无细胞牙骨质和细胞牙骨质中也有表达，但其在成熟的骨形成细胞中表达更明显，因此是成骨细胞分化的晚期标志。本研究免疫组化结果显示骨唾蛋白大量表达，也说明了PDLSCs具有向成骨细胞分化的能力。碱性磷酸酶(ALP)是一种较为肯定的参与促进钙化活动的酶类。但是，目前关于ALP在牙骨质的表达还是个有争议的问题[8]。但ALP在骨细胞中的表达是毫无疑问的，因此，我们把ALP看作是PDLSCs分化为骨形成细胞的标志。在本实验中，矿化诱导后的克隆组细胞ALP活性明显高于对照组，说明PDLSCs分化为成骨细胞数量相当大，并具有成骨的潜在能力。矿化结节的大量形成也说明了这一点。

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　　参考文献
　　[1] Pittenger, M.F., et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999.284(5411): p. 143-7.
　　[2] McCulloch, C.A., et al., Paravascular cells in endosteal spaces of alveolar bone contribute to periodontalligament cell populations. Anat Rec, 1987. 219(3): p. 233-42.
　　[3] Seo, B.M., et al., Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet,2004. 364(9429): p. 149-55.
　　[4] 杨雪超，樊明文。成体人牙髓干细胞的分离与鉴定。中华口腔医学杂志，2005；40：244-247。
　　[5] Zhang, W., et al., Multilineage Differentiation Potential of Stem Cells Derived from Human Dental Pulp afterCryopreservation. Tissue Eng, 2006.
　　[6] Wang, H.L., et al., Periodontal regeneration. J Periodontol, 2005. 76(9): p. 1601-22.
　　[7] Ganss, B., R.H. Kim, and J. Sodek, Bone sialoprotein. Crit Rev Oral Biol Med, 1999. 10(1): p. 79-98.
　　[8] Grzesik, W.J., et al., Normal human cementum-derived cells: isolation, clonal expansion, and in vitro and invivo characterization. J Bone Miner Res, 1998. 13(10): p. 1547-54.0