P>　　摘要 目的:从抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6中扩增克隆重链可变区基因。方法:采用PCR技术和基因工程技术,扩增杂交瘤细胞系2B12F6的重链可变区基因并克隆入载体pUC18,Sanger双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果:重链可变区基因全长360 bp,编码118个氨基酸,其框架区与发表的小鼠重链可变区基因序列有70%的同源性,符合鼠重链可变区基因的结构特征。结论:抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6重链可变区基因的获得是构建抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ基因工程抗体的基础。 　　目前对于抗变形链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(surface protein antigen Ⅰ/Ⅱ,SAⅠ/Ⅱ)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)用于防龋的实验研究已证实该McAb可抑制变形链球菌在牙齿表面的粘附［1,2］,这说明McAb用于防龋值得探讨。但是鼠McAb在人体应用时产生的人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)导致的过敏反应又限制了McAb的应用［3］。随着DNA重组技术的发展,应用基因工程技术可改建鼠McAb从而克服鼠McAb在人体产生的副作用。有关抗变形链球菌SAⅠ/ⅡMcAb基因工程抗体的构建目前在国内尚未见报道。 1 材料和方法1.1 细胞培养［4］　　抗变形链球菌MT6R SAⅠ/ⅡMcAb杂交瘤细胞株2B12F6按杂交瘤细胞培养规则调整细胞数至1×105个细胞。1.2 细胞总RNA提取［5］及cDNA合成　　培养细胞离心后悬浮于10mmol/L TE200μl,置冰浴5分钟,加入5%NP-40 5μl,两次间隔5分钟,再加入10mmol/L TE200μl,2×RES-1400μl及等体积酚/氯仿-异戊醇抽提,离心吸上层液相再反复抽提1次,吸上层液相于Eppendorf管中,加1/10μl 3M NaAc和1倍-20℃无水乙醇混匀,置-70℃ 20分钟,离心弃上清后再用-20℃70%乙醇洗涤1次,37℃干燥,沉淀物溶于12μl DEPC处理的灭菌超纯水中,取1 μl经1%琼脂糖凝胶电泳,紫外光灯下观察结果。按照逆转录试剂盒要求合成cDNA第一链。1.3 PCR扩增及PCR扩增产物补平、回收　　在50μl反应液中含超纯水25μl,10×Taq缓冲液4μl,25 mmol/L MgCl2 3μl,10 mmol/L 4×dNTP2μl,引物各2.5μl,95℃变性5分钟后加Taq DNA聚合酶5μ,然后按94.5℃变性50秒,60℃褪火50秒,72℃延伸60秒,循环35次后72℃继续延伸5分钟,取10μl反应物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。经抽提干燥的PCR产物中加入:超纯水16μl,10×Klenow缓冲液2μl,4×dNTP 1 μl,Klenow酶1μl混匀,置37℃3小时后经2%琼脂糖凝胶电泳回收补平后的PCR产物,并行常规抽提,干燥,-20℃保存备用。1.4 2B12F6VH基因的克隆　　用平端连接法将上述PCR产物与pUC18载体连接,转化入感受态大肠杆菌JM109,随机挑选菌落提取质粒用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,筛选阳性克隆,进一步经三组酶切鉴定。1.5 序列分析　　用双脱氧末端终止法测定序列。按照测序试剂盒说明进行。　　阳性克隆菌种液按1∶100接种于50 ml 2×YT培养液中,37℃摇床培养15小时,抽提及纯化质粒后经变性,褪火及α-P32标记反应,电泳2小时凝胶置-20℃放射自显影24小时后行序列分析。 2 结 果2.1 提取细胞总RNA　　1μl提取物经1%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外光灯下显示28 S和18 S条带清晰,无基因组DNA污染,降解的RNA量较少。2.2 PCR扩增VH基因　　10μl扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后显示扩增产物长度为360 bp,非特异性带少(图1)。 图1　2B12F6VH基因PCR扩增产物A:2B12F6VH基因PCR扩增产物B:DNA marker[PGEM-7zf(+)/HaeⅢ] 2.3 阳性克隆的鉴定　　筛选出的阳性克隆再次经三组酶切鉴定,表明筛选出的阳性克隆含有插入的外源性DNA片段(图2)。 图2　2B12F6VH/PUC18阳性克隆酶切鉴定A:DNA marker[PGEM-7zf(+)/HaeⅢ]B:EcoRI+BamH I酶切片段C:PstI酶切片段D:EcoRI+PstI酶切片段 2.4 序列分析　　2B12F6VH基因核苷酸和氨基酸序列经放射自显影后可见VH基因片段和Kabat抗体基因库中的小鼠抗体重链Ⅱ(A)组有较高的同源性,其特点是:①基因长度为360 bp,序列两端含有PCR引物及正确的酶切位点;②第2位和第96位含有维持抗体结构所必需的半胱氨酸,而且位置正确;③其框架区与发表的小鼠VH序列有70%以上的同源性,并符合鼠VH的结构特征;④所克隆的VH基因可编码118个氨基酸(图3、4)。本新闻共2页,当前在第1页  1  2