P>　　摘要 目的:分析血链球菌染色体DNA片段序列,探讨血链球菌遗传生物学特性。方法:采用TA克隆技术将此片段转化克隆并进行碱基序列测定,通过GenBank进行同源分析。结果:血链球菌ATCC10556 DNA片段含有与固氮菌高度同源的nifS、nifU基因,同源分值为114点(bits)。结论:国内外首次报道血链球菌DNA片段含有nifS、nifU部分基因。

　　血链球菌属口腔固有菌群,近年牙周病微生物学研究显示血链球菌与大多数牙周可疑致病菌部位检出率之间是一种负相关关系。体外实验证实血链球菌对大多数牙周可疑致病菌均有很强的拮抗作用,拮抗机理一方面通过产生细菌素样物质,一方面通过过氧化氢的释放。细菌学检测也显示某些顽固性牙周炎口腔缺乏原藉血链球菌。因此,深入研究血链球菌生物学特性,特别是遗传学行为将为利用血链球菌及其产物防治牙周病提供有效的实验数据,也将对口腔微生物学的深入研究具重要意义。

1 材料和方法
1.1 PCR扩增及产物纯化
　　血链球菌(Streptococcus sanguis,S.s)ATCC10556染色体DNA为模板,引物为S1-S2即5'GAGGTCCACA 3',5'CCTCTGACTG 3'。用PCR方法扩增特异基因片段。50 μl体积PCR反应体系为94℃ 1分钟、45℃ 1分钟、72℃ 1分钟,最后72℃延伸7分钟,35个循环。扩增产物经8%聚丙烯酰胺检测后,用1.5%的低熔点琼脂糖回收特异DNA片段,回收的DNA用WizardTMPCR Preps DNA纯化试剂盒进行纯化,纯化产物经紫外分光光度计进行定量。
1.2 PCR产物的克隆
　　用TA克隆系统(Eukaryotic TA cloning system, Invitrogen)通过载体连接将上述PCR产物直接克隆到PCRTM3真核表达质粒上。
1.3 质粒提取
　　采用质粒纯化试剂盒(plasmid mini kit)快速提取质粒。
1.4 筛选阳性克隆
　　采用限制性内切酶分析方法,用EcoRⅠ消化重组质粒,37℃消化过夜后经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定插入子的片段大小。
1.5 DNA片段碱基序列测定
　　采用荧光素引物标记法(Dye-Primer),使用荧光素标记的通用引物T7。用ABI PRISM 310全自动遗传分析仪对带有原PCR产物的重组体PCR3-S.sr进行测序。
1.6 蛋白氨基酸同源序列分析
　　将已知碱基序列转换为氨基酸序列,进入GenBank系统进行蛋白氨基酸同源序列分析。

2 结 果
2.1 血链球菌PCR扩增及产物纯化结果
　　PCR扩增合成的DNA片段长度约为800碱基对(base pair,bp)清晰单一条带,经过低熔点琼脂糖回收及纯化符合克隆条件(图1)。

图1　血链球菌PCR扩增及800bp片段纯化结果
A：φ174 DNA/Has Ⅲ markers
B:ATCC10556 DNA琼脂糖回收后再次PCR扩增

2.2 血链球菌DNA片段阳性克隆鉴定
　　PCRTM3有两个EcoRI酶切位点,重组质粒PCR3-DNA S.sr经过EcoRI消化后预计得到816 bp的含DNA S.sr基因的片段。电泳结果显示所选择的质粒与预期相符,克隆成功(图2)。

图2　重组质粒EcoRI酶切结果　A、B的酶切片段长度与预期基本符合

2.3 血链球菌克隆基因序列分析结果
　　根据限制性内切酶分析结果,测序后所读出的序列应为载体序列→S1-S2引物序列→S.sr DNA碱基序列→载体序列,测序结果与预期完全相符。
2.4 血链球菌克隆基因蛋白同源序列分析
　　通过GenBank的Database similarity search检测,显示氨基酸序列的6个阅读框架与nifS,nifU基因具有高度同源性,与已知16个微生物nifS和nifU基因含有部分同源序列,同源分值为114点,符合同源标准(表1)。

表1 ATCC10556 nif基因同源序列分析

细菌名称 (Genebank 分类号)	ATCC10556 克隆表达基因 碱基序列号	被查询的细菌 蛋白基因碱基 序列号	阅读 框架	同源 分值
麻风分枝杆菌	558～701	113～160	+3	107
S72754	365～544	47～106	+2	91
大肠杆菌	9～140	329～372	+3	102
d1016178	143～223	373～399	+2	73
麻风分枝杆菌	24～134	536～572	+3	99
e335040	152～223	578～601	+2	54
集胞藻菌属	30～203	344～401	+3	114
d1011196	143～229	381～409	+2	79
麻风分枝杆菌	27～179	345～395	+3	105
s72761	150～220	386～408	+2	72
大肠杆菌	18～131	326～363	+3	74
882705	146～220	368～392	+2	70
肺炎支原体	371～529	44～96	+2	89
p75297
肺炎克氏杆菌	392～493	51～84	+2	69
s37295	597～656	101～120	+3	43
大肠杆菌	383～502	49～88	+2	76
l788878
流感嗜血杆菌	383～502	49～88	+2	75
1573346
流感嗜血杆菌	383～502	74～113	+2	75
c64064
流感嗜血杆菌	24～119	365～396	+3	61
I64114	155～220	408～429	+2	48
兰绿藻目菌	392～502	56～92	+2	71
2183204	603～656	108～125	+3	36
酵母菌	389～502	84～121	+2	71
s69049
棕色固氮菌	383～502	49～88	+2	70
2271522
生殖支原体	371～511	44～90	+2	67
p47579