P>3 讨 论
3.1 血链球菌部分DNA片段基因克隆与表达分析
　　本实验采用的TA克隆技术原理是Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性的活性,能在双链DNA分子的3'末端添加一个A。因此,PCR产物的3'末端均突出一个A,真核TA克隆系统正是利用Taq DNA聚合酶这种特性设计了一种3'末端突出单个T的能在哺乳动物细胞直接表达的线性质粒PCRTM3。根据T-A互补原理,PCR产物可以直接连结到真核表达载体上［1,2］。本文选择较短一对引物即10个碱基,目的在于寻找口腔链球菌DNA多态位点的差异,结果显示ATCC 10556在PCR扩增产物800 bp左右有一DNA条带,扩增结果稳定,显示较强的特异性,经过纯化仍可扩增说明特异及纯化度较高。通过核酸序列分析,前55个碱基为已知的载体序列,55位至65位为原引物序列,表明运用真核TA克隆表达PCR产物获得成功,并获得了部分血链球菌的遗传基因。
3.2 血链球菌nifS、nifU基因同源序列分析
　　nif基因(nitrogen fixed gene)被发现在固氮菌中,属于固氮酶基因［3～5］。Walter Arnold于1988年首次报道克氏肺炎杆菌nif基因全序列为24206个碱基的DNA片段,其中nifS和nifU是固氮酶的成熟基因［6］。血链球菌ATCC 10556的DNA片段与16种微生物的nif基因进行同源序列分析,显示具有较高的同源性。在血链球菌DNA片段克隆表达的氨基酸序列中,+2阅读框架主要含有nifU基因同源序列,+3阅读框架主要含有nifS同源基因序列。
3.3 血链球菌nif基因的生理功能推测
　　对于固氮菌的生理功能研究提示,此类细菌具有自生固氮活性［7］。通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮,同时在固氮中释放氢气,其中钼铁蛋白和铁蛋白复合物-固氮酶起催化调节作用［8］。
　　血链球菌是口腔链球菌中释放过氧化氢的微生物。血链球菌主要通过释放过氧化氢和细菌素达到防止外来菌侵入口腔的作用。什么机制导致血链球菌能够释放过氧化氢而其它细菌如变形链球菌、唾液链球菌无此功能一直未有明确答案。血链球菌是口腔早期定植菌,除了血链球菌具有较强粘附牙面的作用,导致血链球菌长期存留于口腔可能与其它影响因素有关。血链球菌不属于固氮菌,却含有nifS、nifU基因,能否推断血链球菌具有类固氮样作用,在血链球菌营养代谢中显示比其它细菌更具有优势而存在于口腔。通过对固氮菌在固氮过程中释放氢气提示血链球菌释放过氧化氢的机理可能与nif基因表达相关,因此深入研究nif基因表达与血链球菌产生过氧化氢机理相关性研究具有重要意义。