P class=tt1>　　摘要　目的:探讨骨形成蛋白-2(BMP-2)和转化生长因子β(TGFβ)对细胞增殖分化的调控作用及其机制。方法:构建含有人BMP-2基因的噬菌粒表达载体pBK-B2,利用脂质体转染方法将其导入NIH3T3细胞,通过G-418筛选获得阳性细胞克隆。细胞原位杂交、免疫组化法检测BMP-2基因的稳定转染及表达,并检测了外源性TGFβ对转染细胞增殖活力及碱性磷酸酶活性和骨钙素含量的影响。结果:TGFβ(50 ng/ml)促进BMP-2转染细胞的增殖,但是抑制其碱性磷酸酶活性和骨钙素的含量。结论:TGFβ的生物学效应与多种因素密切相关,BMP和TGF-β在细胞生长分化过程中具有协同作用。

=left>　　骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)作为骨的生长因子属于TGFβ超家族的一个成员。BMPs的一个重要特点是能在非骨组织如肌肉中诱导新的软骨和骨形成,随着对BMPs研究的不断深入,揭示了它在形态发生和细胞分化过程中发挥重要的作用。BMP家族至少包括20个成员,其中BMP-2被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子。转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFβ)对多种组织细胞的生长分化及功能过程具有调控作用,它与BMPs最明显的区别是TGFβ本身无异位成骨的作用。本文以BMP-2基因为目的基因,以小鼠成纤维细胞为载体细胞,建立了稳定表达BMP-2的细胞株,并检测了外源性TGFβ对转染细胞的增殖活力和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨钙素(osteocalcin,OC)含量的影响,进一步从分子水平探讨BMP-2和TGFβ对细胞增殖分化的调控作用以及二者的作用机制。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要材料

　　pBK-B2噬菌粒表达载体由第四军医大学口腔医院病理科构建^［1］,Lipofectamine转染试剂盒、DMEM、G-418为美国Gibco公司产品。ABC试剂盒为美国Vector公司产品。牛血小板TGFβ由第四军医大学口腔医院病理科制备^［2］。MTT为美国Sigma公司产品。ALP检测试剂盒购自广州标佳科技有限公司,OC放免检测试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所。

　　1.2　基因转染和克隆筛选

　　采用脂质体载体(lipofectamine)将pBK-B2转染NIH3T3细胞。转染3 d后,弃去原培养液,加入含G-418(500 μg/ml)的DMEM培养液(含10%FCS),在标准环境下培养,15 d后绝大多数细胞死亡,收集G-418抗性的细胞克隆,扩大培养并制备细胞爬片。

　　1.3　原位杂交^［3］

　　细胞爬片经4%多聚甲醛(PFA)/PBS(pH7.4)固定,分别用0.3%Triton X-100/PBS、0.1 mol/L HCl及蛋白酶K处理,4%PFA后固定及逐级酒精脱水干燥后,滴加热变性后的含地高辛标记BMP-2探针的杂交液,42℃杂交过夜。缓冲液2×SSC、1×SSC、0.5×SSC充分漂洗,正常羊血清封闭,然后滴加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(Anti-DIG-AP)37℃温育2 h。缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅲ充分漂洗后,NBT/BCIP暗处显色20 h。TE终止反应,逐级酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

　　1.4　免疫组化

　　已固定的细胞爬片经1%H₂O₂/PBS、0.3%Triton X-100/PBS处理后,滴加正常马血清37℃温育30 min,弃去血清后滴加鼠抗人BMP-2单抗(G8A6),4℃过夜。滴加生物素化的羊抗鼠IgG,37℃温育30 min。滴加ABC复合物37℃温育30 min,上述各步之间均以PBS充分振洗。最后滴加新鲜配制的DAB显色液,室温10 min,蒸馏水洗终止反应,苏木精衬染,逐级酒精脱水后二甲苯透明,中性树胶封片。

　　1.5　MTT检测

　　转染细胞以4×10³的细胞密度(200 μl)接种于96孔板,在含10%FCS的DMEM、标准环境下培养3 d后,弃去原培养液,每孔加含1%血清DMEM稀释的TGFβ,终含量分别为5 ng/ml、50 ng/ml和500 ng/ml,继续培养3 d后,每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl,继续培养4 h,轻轻吸尽上清,加150 μl DMSO振荡15 min,使结晶物充分溶解,用ELISA仪测定490 nm的光密度(OD)值。同时设空白对照。采用统计学软件Statgraphics(3.0版本)进行组间统计学分析,下同。