P class=jie align=left>　　摘　要：目的:探讨口腔粘膜上皮角朊细胞(KC)和细胞因子在口腔粘膜下纤维性变(OSF)发生中的作用。方法:分别从正常及OSF组织培养出KC(NM-KC和OSF-KC),用放射免疫法和酶联免疫吸附法测定培养细胞上清液中内皮素(ET)和β₁转化生长因子(TGFβ₁)的水平。结果:OSF-KC分泌ET和TGFβ₁水平均高于NM-KC(P＜0.05),且两者呈正相关关系。结论:外源性刺激导致的KC活化及其分泌的ET和TGFβ₁的改变可能在OSF发生中起重要作用。

　　口腔粘膜下纤维性变(or

al submucous fibrosis,OSF)是一种慢性、隐匿性、具有癌变可能的炎性疾病。尽管研究表明OSF的发生与咀嚼槟榔习惯密切相关^［1］,但其发病机理仍不明确,多数学者在研究OSF的发病机理时把成纤维细胞(fibroblast,FB)作为主要研究对象。FB位于粘膜下组织中,是合成胶原的主要细胞,无疑在OSF发生中具有重要作用^［2，3］。但在咀嚼槟榔过程中,与咀嚼物首先接触的是口腔粘膜上皮,而不是粘膜下组织;而且临床上发现除与咀嚼物密切接触易受摩擦等机械损伤的部位,如颊、舌、牙龈等外,与咀嚼物不密切接触,理化刺激难以直接到达粘膜下组织的部位,如软腭、口底等也可出现纤维病变^［4］。近年的研究表明皮肤和粘膜角朊细胞(keratinocyte,KC)能分泌包括内皮素(endothelin,ET)、β₁转化生长因子(transforming growth factor β₁,TGFβ₁)在内的多种细胞因子^［5，6］,它们与纤维性疾病的发生密切相关。笔者推测:OSF发生中,外源性刺激物除可直接通过被破坏的上皮屏障作用于粘膜下组织外,还可能通过刺激上皮细胞,产生如细胞因子等的间接作用使FB增殖,从而导致胶原堆积。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要试剂及仪器

　　DMEM培养基、小牛血清(杭州四季青生物制品厂)、分散酶Dispase Ⅱ、胰蛋白酶、兔抗人细胞角蛋白抗体(Zymed公司)、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Zymed公司)、内皮素放射免疫检测试剂盒(购自北京东亚免疫技术研究所)TGFβ₁ ELISA试剂盒(购自深圳晶美生物工程有限公司,为美国Genzyme公司产品)、24孔培养板(Nunclon公司)、γ计数器(中国科学技术大学开发研究院)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　KC的培养与鉴定 标本来源及KC的培养、鉴定方法见参考文献［7］。

　　1.2.2　ET的测定 将KC细胞以2×10⁵/ml的密度接种于24孔板,待细胞达70%～80%融合时,换用新鲜培养基。培养48 h,收集培养细胞上清液,-70℃保存,用于检测ET和TGFβ₁。采用ET放射免疫药盒,使用GC-911放射免疫伽马计数器,严格按药盒要求的操作方法检测标本中的ET值。每1组均设3个平行孔。

　　1.2.3　TGFβ₁的测定 由于细胞分泌的TGFβ₁一般为非活化型,需进行激活后再检测,取200 μl稀释液加入到200 μl细胞上清液标本中,再加入1 mol/L HCl₂ 20 μl 2～8℃放置1 h,使TGFβ₁激活,然后加入1 mol/L NaOH 15 μl进行中和。采用市售TGFβ₁ ELISA试剂盒检测样品中TGFβ₁含量。在450 nm处读数,记录OD值,绘制标准曲线,以样本的OD值推算TGFβ₁浓度。

　　1.2.4　统计学方法 应用SPSS软件进行数据分析,均数比较采用方差分析,OSF-KC分泌ET和TGFβ₁的关系采用直线相关分析,检验标准α=0.05。

　　2　结 果

　　KC分泌的ET及TGFβ₁水平：由表1可见,口腔粘膜KC能分泌一定基础水平的ET和TGFβ₁,而且OSF-KC分泌的ET及TGFβ₁水平均高于NM-KC的分泌量(P＜0.05),经直线相关分析发现OSF-KC分泌的ET和TGFβ₁之间呈正相关(r=0.968,P＜0.05)。

表1　口腔粘膜KC分泌的ET和TGFβ₁水平(±s)

组别	ET(pg/ml)	TGFβ1(pg/ml)
NM-KC	14.641±15.796	2505.025±1486.676
OSF-KC	96.983±17.802*	4661.642±783.893*

* OSF-KC与NM-KC比较P＜0.05

　　3　讨 论

　　口腔粘膜上皮细胞多为KC,近年的研究表明KC不但能产生许多大分子量分子(如细胞角蛋白及粘多糖)保持口腔粘膜生化及物理的完整性;而且可分泌一系列具有免疫、炎性、增殖性特点的细胞因子