叶 　 玲 ,苏 　 勤 ,周学东 ,谭 　 红
(四川大学华西口腔医院 　 牙体牙髓科 ,四川 　 成都 610041)
[摘要] 　 目的 　 采用体外微核法评价新型纳米根管充填材料 nHA- PA66的基因毒性。方法 　以 V79细胞作为实验
细胞 ,采用新型纳米根管充填材料 nHA- PA66 粉剂及混合物的浸提液作为实验组 ,丝裂霉素 C为阳性对照组 ,用
MTT法检测各组的细胞毒性 ,以 V79细胞中所形成的微核数作为标准评价材料的基因毒性。结果 　实验组的 MTT
值在各个时间段与阴性对照组无显著性差异( P > 0105) ;所形成的微核数(粉剂组 :611±111?1 000 ;混合物组 :517±
016?1 000)与阴性对照组(513±018?1 000)无显著性差异( P > 0105) ,而与阳性对照组(12319±8?1 000)有显著性差异
( P < 0105) 。结论 　 本实验显示新型纳米根管充填材料 nHA- PA66无细胞毒性及基因毒性 ,生物相容性好。
[关键词] 　 体外微核法 ; 　 基因毒性 ; 　 纳米材料
[中图分类号] 　R 781. 05　[文献标识码] 　A
G enotoxicity of a New N anoHA - PA66 Root Fi lling Material in vitro　YE Ling , SU Qin , ZHOU Xue - dong , TAN Hong.
( Dept . o f Endodontics , West China College o f Stomatology , Sichuan Univer sity , Chengdu 610041 , China)
[Abstract ] 　Objective　The micronucleus test was applied to evaluate the genotoxicity of a new nanocomplex HA - PA66 root
filling material in vitro. Methods　The dulbecco′ s modi fied eagle media (DMEM) extracts of the powder part and the mixture of
the new nanomaterial were prepared separately. The V79 cell was used as the test cell and the mitomycin C(MMC) as the positive
control . The MTT assay was employed in our study to evaluate the cytotoxic effect while the number of micronucleus was used as
the criteria for the detection of genotox ocity. Results　The MTT values in test groups and negative group were not signi ficantly di f2
ferent at di fferent times ( P > 0. 05) . The number of micronucleus in test groups (powder group : 6. 1 ±1. 1?1 000 ; complex
group : 5. 7±0. 6?1 000) was similar to the negative control (5. 3±0. 8?1 000 , P > 0. 05) , while they were signi ficantly di fferent
to the positive control (123. 9±8?1 000 , P < 0. 05) . Conclusion　The new nanocomplex HA- PA66 root filling material showed no
detectable cytotoxic and genotoxic effects in this study and was proved to be biocompatible.
[ K ey words] 　in vitro micronucleus ; 　genotoxicity ; 　nanomaterial

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　　 随着牙科材料及器械的发展 ,现代根管治疗将重点放在了根管预备和根管充填上。只有充分、 有效而严密的根管充填才能达到根管治疗的最终目的 — — —治疗或预防根尖周疾病的发生。根据 ISO-10993 标[1 ]准 ,根管充填材料属于永久性的植入材料 ,必须具有良好的生物相容性。新型根管充填材料在临床使用前 ,必须进行生物相容性检测 ,包括组织学、 细胞学、 基因及分子学等不同水平的生物学评价。其中 ,基因毒性主要包括基因突变、 染色体异常或基因组的改变 ,其检测可通过体外及体内实验进行 ,其中体外实验由于操作方便及代表性强而多用作初步筛选实验。细胞水平的基因毒性主要表现为染色体量及结构的异常 ,体外微核法 (micronucleus test in vitro ,MNT)是最常用于检测染色体异常的实验方法。新型1 1 ?1 1 1 ?司 ,美国) ;细胞培养仪( INFO-3公司 ,日本) 。

1. 2　 细胞来源 V79细胞(四川大学华西公共卫生学院提供) 。

1. 3　 材料浸液的制备采用细胞培养液 DMEM制备新型纳米根管充填材料 nHA- PA66 的浸提液。材料经高温高压消毒灭菌 ,DMEM培养基经滤过除菌 ,将材料的粉剂和粉、 液混匀后固化 24 h的混合物粉碎后 ,各取 1 g分别加入 10 ml 细胞培养基DMEM中。振荡混匀后在细胞培养孵箱中 37 ℃ 放置 7 d ,离心后取出上清液 ,再进行梯度稀释(初始浓度相当于材料?浸液∶ 100 mg?ml) ,滤过除菌后备用。

1. 4　 细胞毒性试验(dimethylthiazol diphenyltetrazolium assay , MTT) 本实验分为实验组和对照组 ,实验组细胞中加入材料浸提液 ,对照组加入细胞培养基 DMEM。实验组又根据材料浸液的不同而分为粉剂组 ( P)和混合物组(M) ,两组的系列稀释又产生了 P 1、 P 2、 P 3、 P 4、 P 5组和M 1、 M 2、 M 3、 M 4、 M 5组。P 1组材料粉剂浸液浓度 100 mg?ml ;M 1 组材料混合物浸液浓度 100 mg?ml ; P 2及M 2 组浓度为 50 mg?ml ; P 3 及 M 3 组浓度为 25 mg?ml ;P 4及 M 4组浓度为 1215 mg?ml ; P 5及 M 5组浓度为 6125 mg?ml。 4 将V79细胞复苏后 ,以 10 个?毫升的浓度接种于 96孔细胞培养板中 ,每 3孔 1组 ,加入 DMEM培养基、 10 %小牛血清及青链霉素 ,在含 5 %CO 2 空气、 37 ℃ 下培养。24 h细胞贴壁后 ,更换细胞培养基 ,实验组每孔加入 200μl 不同浓度的材料浸提液 ,阴性对照组中加入新鲜 DMEM培养基;分别培养 1、 3、 5 d后每孔加入MTT ,4 h后中止反应 ,进行分光光度计读数 ( λ= 570 nm) 。

1. 5　 体外微核试验(micronuleus test , MNT) 本实验分为实验组、 阳性对照组和阴性对照组 , 实验组加入 5 ml 粉剂和混合物的初始浓度浸提液 (100 mg?ml) ;阳性对照组加入 5μg?ml 的 CTC + S9 ,阴性对照组加入 DMEM培养基。 4 将 V79 细胞以 10 个?毫升的浓度接种于细胞培养皿中的玻片上 ,每个培养皿中放入 3 块 (1 cm × 1 cm)玻片。同 114 培养条件下培养 24 h 细胞贴壁后 ,更换培养基 ,按实验分组加入不同的试剂。再培养 24 h ,终止反应。将玻片取出 ,甲醇和冰醋酸(3∶ 1) 固定后 ,PBS洗涤 ,用 G iemsa染色 ,自然晾干后用树胶封片。在显微镜下观察并计算微核的数目。每张片子计数 2 000个细胞 ,所得的微核数目取均值作为该组的数据。

1. 6　 统计分析采用单因素方差分析进行数据的统计分析。

2　 结果