目的：克隆小鼠釉原蛋白(AMG)成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠釉原蛋白成熟区的基因片段(约670 bp)，将所得基因片段插入pBS质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-AMG的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉原蛋白成熟肽编码区基因。
关键词 釉原蛋白；cDNA；聚合酶链反应；小鼠
成熟釉质中无机物占总重量的98%以上，是人体组织中矿化程度最高的组织。但发育中的釉质富含蛋白质和水，蛋白含量高达25%～30%。这些釉质基质蛋白中可分为两大类：釉原蛋白(amelogenin，AMG)和非釉原蛋白（non-amelogenin）。其中釉原蛋白占90%，是发育中釉质基质蛋白的主要成分，在釉质矿化和成熟中发挥着重要的作用［1］。本文采用逆转录PCR技术克隆小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA，为表达该蛋白和研究其生物学效应打下基础。
1 材料和方法
根据小鼠釉原蛋白的cDNA序列［1］，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。5'端引物碱基序列为：5' TGGTTGCACGGACTTCTCCC 3'；3'端的引物序列为5'TAGTGCTCTTAACACCTTCACTGCG3'。载体质粒pBS用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆pBS-AMG。
小鼠磨牙牙胚总RNA的提取、逆转录PCR扩增、PCR产物的克隆、酶谱分析和核苷酸序列分析与郝建军等的报道相同［2］。
2 结果
2.1 总RNA
提取的新生小鼠牙胚总RNA电泳［2］，可见28S、18S和5S三条带，其中28S的带最亮，28S带亮度约为18S带的2倍，表明所获得的总RNA无明显的降解。
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约670bp的特异扩增产物(附图)。
2.3 pBS-AMG克隆的酶谱分析（附图）
附图 PCR扩增产物AMG和重组质粒pBS-AMG酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA-PstI
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的AMG PCR产物
4.重组质粒pBS-AMG经EcoRI和BamHI双酶切
5.pBS- AMG经Hind Ⅲ酶切
6.重组质粒pBS-AMG
7.载体质粒pBS
8.λDNA-Pst1
9.目的产物AMG
10.阴性产物(未加模板)
重组质粒pBS-AMG经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(附图，第4道)，670bp的釉原蛋白和2.96kbp的载体pBS。670bp的釉原蛋白与 PCR的目的产物电泳条带(3、9道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(7道)平齐。重组质粒pBS-AMG经 HindⅢ酶切后的电泳图谱(5道)与预期的完全一致。
2.4 p
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