摘要　目的:乳牙菌斑中的蛋白水解酶是否与乳牙龋的发生发展有关。方法:采用酶-底物反应法和考马斯亮蓝蛋白含量测定法，分别测定有龋和无龋儿童乳牙集合菌斑中亮氨酸氨肽酶、甘氨酰脯氨酸二肽酶和胰酶样蛋白酶的活性及总蛋白含量。结果:3种蛋白水解酶的酶活性和总蛋白含量在有龋组和无龋组均无统计学差异（P＞0.05)。结论:3种蛋白水解酶可能与乳牙有机质的分解破坏关系不大。

　　根龋的研究表明^［1,2］：蛋白水解酶与根面牙本质牙骨质中有机质的降解密切相关，酸和蛋白水解酶的协同破坏作用是根龋发生发展的主要病理机制。乳牙龋虽多为冠部牙釉质龋损，但乳牙牙釉质在有机质含量、矿化程度等方面与恒牙牙本质牙骨质具有很强的相似性，这提示蛋白水解酶也可能与乳牙龋的发生发展有关。本文通过研究3种常见蛋白水解酶在不同龋敏感儿童乳牙菌斑中的活性，初步探讨蛋白水解酶与乳牙龋的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　设备和试剂

　　高速低温离心机（Heraeus 24-3，德国），十万分之一电子分析天平（1／103AE-240，Sartorius，德国），紫外-可见分光光度计（岛津2000型，日本），荧光分光光度计（岛津RF-5000型，日本）， EL3123e读数器（BI0-TEK，Instruments，美国）。

　　用Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 7.5，Sigma，美国）分别配制浓度为100 μg／ml的Leu-AMC（亮氨酸-7-氮基-4-甲基香豆素，Sigma，美国），Gly-Pro-AMC（甘氨酰-脯氨酸 7-氮基-4-甲基香豆素，Sigma，美国）荧光底物液及0．2 mmol／L的L-BApNA（苯甲酰-L-精氨酸对硝基苯胺，Sigma，美国）底物液。

　　用甲醇配制10 mmol／L的7-氨基-4-甲基香豆素（AMC，Sigma，美国）标准品，再用Tris-HCl缓冲液稀释成10、 20、 40、 60、80、100 μg/ml 6个梯度作标准曲线。

　　1.2　样本收集和处理

　　在成都市第五幼儿园随机抽取20名5～6岁的儿童，分为有龋组(dmft≥6)和无龋组，两组儿童性别基线相同，其六龄牙正萌或未萌，除龋外均无其它口腔疾病，全身健康，无长期服药史（包括使用氟剂）等。

　　正常饮食，菌斑收集前24 h禁止口腔卫生，于上午9～10时，清水漱口去除食物残渣，纱团隔湿、干燥菌斑收集区，用无菌刮匙收集全口乳牙集合菌斑，立即置于高速离心管内，冰浴下转送-40 ℃冰箱内贮存。

　　用电子天平称取每份牙菌斑样本湿重，按 1∶10(g／ml)加入Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L,pH 7.5）后超声匀浆，低温离心（20000 g,5 min），收集上清液待测。

　　1.3　酶活性和总蛋白含量测定

　　用荧光底物及有色光底物微量测定法测定菌斑液中3种蛋白水解酶——亮氨酸氨肽酶（LAP）、甘氨酰脯氨酸二肽酶（DPPIV）和胰酶样蛋白酶（TLP）的活性，采用考马斯亮蓝蛋白含量测定法测定菌斑中总蛋白含量^［3］。

　　1.4　统计分析

　　采用成组设计单因素方差分析对不同龋敏感组的酶活性进行比较。

　　2　结　　果

　　3种蛋白水解酶在有龋组和无龋组的酶活性见表1，其差异均无统计学意义。有龋组和无龋组乳牙菌斑中总蛋白含量分别为 9．374±1．240 mg和8．436±2．212 mg，其差异也无显著性（P＞0.10）。

表1　不同龋敏感儿童乳牙菌斑中酶活性比较(±s,U/mg)

　　3　讨　　论

　　近年来，儿童乳牙患龋率随蔗糖消耗量的增加呈明显上升趋势。乳牙龋发生的特点为：①发展迅速；②可同时在多数牙和牙面上发生；③下前牙及光滑面较常累及等。这些特点与乳牙的生物化学组成有很大关系。研究表明^［4］乳牙釉质矿化程度较低，有机质含量较大,这与恒牙釉质有明显差别，但却与牙本质和牙骨质相似。虽然恒牙釉质龋是酸脱矿作用的结果，但研究发现胶原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶作用于釉质可使有机蛋白组份释出^［5］，枯草杆菌肽酶与胶原酶可破坏釉质内的有机成分^［6］，而人工龋形成过程中釉原蛋白、釉蛋白的抵抗作用^［7］均表明蛋白水解酶在恒牙釉质龋发生中有一定作用，而蛋白水解酶确与根龋的发生发展有关。因此，有必要明确蛋白水解酶在乳牙龋中的作用和地位。

　　实验结果显示：3种蛋白水解酶——亮氨酸氨肽酶、甘氨酰脯氨酸二肽酶和胰酶样蛋白酶均可在儿童乳牙菌斑中测得，但其活性在有龋组和无龋组并无差异。分析其原因，可能为:①本研究所测菌斑样本均以一个儿童所有乳牙牙面集合菌斑为单位,有龋组虽dmft≥6,但仍包含有许多无龋牙面的牙菌斑，这可能掩盖了有龋牙面牙菌斑在蛋白水解酶活性上的不同；②牙菌斑是一个极其复杂的微生物环境，具有个体及部位的特异性，即使同一部位不同深度的龋坏，微生物组成与代谢物也不相同^［8］，酶种类、活性和含量自然也不相同，因此,针对特定菌斑进行蛋白水解酶研究需技术和方法的进一步发展和完善；③本实验所测菌斑蛋白水解酶多为水解胶原蛋白的酶，但乳牙釉质中蛋白成份尚不清楚，这些均导致本实验不同龋敏感儿童牙菌斑中3种蛋白水解酶活性无显著差异，但并不能排除其它相关蛋白水解酶在乳牙龋中的作用。因此，在分析清楚乳牙釉质主要有机质成分和含量的基础上，有针对性的研究相关蛋白水解酶在乳牙龋中的作用有利于对乳牙龋发病机制的全面认识。