摘 要 目的：探讨慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉菌(porphyromonas gingivalis,Pg)和伴放线放线杆菌(actinomycetemcomitans actinobacillus,Aa)所携带的不同基因与临床症状间的关系。方法：采用PCR对66位患者127例龈下菌斑中的Pg 16SrDNA基因、prtC基因、fimA基因以及Aa 16SrDNA基因、1ktA基因和fap基因进行检测；并对上述基因的检出与牙周袋深度、牙槽骨吸收程度、松动度以及牙龈指数(gingival index,GI)和菌斑指数(plaque index,PLI)间的关系进行了统计分析。结果：在127例龈下菌斑中，Pg 16SrDNA、prtC和fimA的阳性率分别为90.6%、81.9%和78.0%，Aa 16SrDNA、1ktA和fap的阳性率分别为92.1、81.1%和29.9%。fimA阳性率与牙周袋深度有关(P=0
.004),在大于7 mm的牙周袋中阳性率最高(P＜0.05)。Pg prtC、fimA和Aa fap的检出率都与GI有关(P＜0.05)。Aa fap阳性率与PLI有关(P=0.002)。结论：fimA在较深的牙周袋中更易检出。Pg partC和Aa fap可能与轻度炎症有关。
关键词 慢性牙周炎 龈下菌斑 牙龈卟啉菌 伴放线放线杆菌 聚合酶链式反应 症状

Relationships between clincal symptoms and detection of different genes of Porphyromonas gingivalis and Actinomycetemcomitans actinobacillus in subgingival plaques
Wu Yanmin,Chen Lili,Yan Jie,et al.the 2nd Affiliated Hospital,College of Medical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 3100009,China
Abstract:Objective:To find the relationships between clinical symptons of chronic periodontitis and frequencies of different genes of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Actinomycetemcomitans actinobacillus in subgingival plaques.Methods:Polymerase chain reaction assays were used to detect Pg 16SrDNA gene,collagenase gene (prtC),fimbrillin gene (fimA),Aa 16SrDNA gene,leukotoxingene (lktA),and fimbriae associated protein gene (fap) in 127 subgingival plaque samples from 66 chronic periodontitis patients.The relationships between the detection rates of these genes and clinical parameters such as pocket depth,alveolar bone resorption,tooth movement,gingival index (GI) and plaque index (PLI) were statistically analyzed.Results:In 127 subingival plaque samples,the positive rates of Pg 16SrDNA,prtC,fimA,Aa 16SrDNA,lktA and fap gene detection were 90.6%,81.9%,78.0%,92.1%,81.1% and 29.9% respectively.The positive rate of fimA was highest when pocket was deeper than 7 mm (P＜0.05).The positive detection rates of prtC,fimA and fap were found to be associated with GI (P＜0.05).The posi
tive rate of fap has something to do with PLI (P=0.002).Conclusion:fimA genewas more easily found in deep pockets.prtC and fap may play a role in slight inflammation of periodontal tissue.
Key Words:Chronic periodotitis; Subgingival plaque; Porphyromonas gingivalis; Actinomycetemcomitans actinobacillus; Polymerase chain reaction (PCR); Sympton

    通常认为牙龈卟啉菌(porphyromonas gingvialis,Pg)和伴放线放线杆菌(actinomycetemcomitans actinobacillus,Aa)是慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)的主要病原菌。在龈下菌斑中检测Pg和Aa对于牙周炎的诊断、疗效判断以及预防等方面均有重要意义。Pg和Aa临床分离菌株毒力基因的携带及表达情况存在差异［1，2］，故检测Pg和Aa毒力基因有助于阐明Pg和Aa的致病机理。16SrDNA基因具有高度保守性和种特异性，故常在PCR中作为不同种类细菌鉴别的靶基因。本文采用PCR方法检测了Pg16SrDNA基因、胶原酶基因(prtC)和菌毛基因(fimA),以及Aa 16SrDNA基因、白细胞毒素基因(lktA)和菌毛相关蛋白基因(fap)，并初步探讨了上述基因的检出与患者临床症状间的关系。

1 材料与方法
1.1 病例来源：66位CP患者均为本科门诊的初诊患者，就诊前1个月内未服用任何抗生素。其中男性22名，平均年龄45.6岁，女性42名，平均年龄37.1岁。

1.2 临床资料记录：记录患牙的牙周袋深度、牙槽骨吸收程度、松动度以及牙龈指数(gingival index,GI)［3］、菌斑指数(plaque index,PLI)［4］。
1.3 龈下菌斑标本的采集和处理：在66位患者中共采集了127例龈下菌斑标本。采集的龈下菌斑置于200 μl TE缓冲液中，-20℃保存。临用前解冻，加入终深度为1%(v/v)的Triton X100 (Serva)，混匀后100℃水浴10 min,取10 μl上清液作为PCR的模板。
1.4 PCR引物：Pg 16SrDNA引物［5］：5′AGGCAGCTTGCCATACTGCG3′(sense)，5′ACTGTTAGCAACTACCGATGT3′(antisense)。Pg prtC引物［6］：5′ACAATCCACGAGACCATC3′(sense),5′TTCAGCCACACCGAGACG3′(antisense)。Pg fimA引物［7］：5′ATAATGGAGAACAGCAGGAA3′(sense),5′TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC3′(antisense)。Aa 16SrDNA引物［5］：5′GCTAATACCGCGTAGAGTCGG3′(sense),5′ATTTCACACCTCACTTAAAGGT3′(antisense)。Aa lktA引物［8］：5′TCGCGAATCAGCTCGCCG3′(sense),5′GCTTTGCAAGCTCCTCACC3′(antisense)。Aa fap引物［9］：5′ATTAA ATACTTTAACTACTAAAGC3′(sense),5′GCACTGTTAACTGTACTAGC3′(antisense)。引物由Sangon公司合成。预期Pg 16SrDNA、prtC和fimA扩增产物长度分别为404、584和131 bp。Aa 16SrDNA、lktA和fap扩增片段预期大小为443、285和210 bp。引物均由Sangon公司合成。
1.5 PCR反应条件和对照设置：①Pg 16SrDNA:反应总体积100 μl，内含10 μl模板、10 μl 10×PCR缓冲液(pH 8.4)、25 pmol引物、1.5 mmol/L MgCl2、0.25 mmol dNTP、0.001%(w/v)明胶和2.5 U Taq酶(Gibco BRL)：PCR参数为：94℃ 5 min×1,94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 1.5 min,×35，72℃ 7 min×1；②fimA：除引物深度为50 pmol、MgCl2浓度为2.5 mmol/L退火温度为52℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；③prtC:除MgCl2浓度为2.5 mmol/L和退火温度为50℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；④Aa 16SrDNA:除MgCl2浓度为2.5 mmol/L和退火温度为60℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；⑤Aa lktA:除退火温度为55℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；⑥fap:除引物浓度为50 pmol、MgCl2浓度为1.5 mmol/L和退火温度为50℃外，其余均与Pg 16SrDNA检测相同；采用Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer)进行扩增。检测Pg prtC和fimA时以Pg ATCC33277 DNA作为阳性对照，以Aa Y4 DNA为阴性对照，等体积超纯水作为空白对照。检测Aa lktA和fap时以Aa Y4 DNA为阳性对照，以Pg ATCC33277 DNA为阴性对
照，等体积超纯水作为空白对照。

1.6 PCR的敏感性：用GeneQuant Ⅱ RNA/DNA Calculator (Pharmacia Biotech)测定Pg ATCC3327株DNA提取物260 nm处的OD值，按下列公式计算DNA浓度：DNA浓度(μg/ml)=OD260×50×稀释倍数。将已知DNA浓度的模板连续10倍稀释后进行扩增。
1.7 扩增产物检测：用含1 μg/ml溴乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用123 bp Marker(Gibco BRL)估计产物长度。
1.8 统计方法：采用SPSS9.0软件进行统计分析。