【摘要】　目的　明确牙周炎及胃病患者的牙菌斑中是否存在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）及Hp是否为细胞毒素相关基因A（cytotoxin-associated gene A，cagA）阳性。方法　利用尿素酶C基因和cagA设计引物, 通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测口腔中的Hp。选择13例胃病及10例牙周炎患者，每例患者选6个有牙龈炎症的牙位取龈上、龈下菌斑，共计276份样本用于PCR检测。结果　胃病组11例患者和牙周炎组全部病例均至少有1份菌斑样本检出Hp，其中尿素酶C基因在胃病组的阳性率为28.8%（45/156），在牙周炎组为49.2%（59/120）；尿素酶C基因和cagA基因共同阳性率在胃病组为3.2%（5/156），在牙周炎组为3.3%（4/120）。取样部位Hp的检出与探诊深度及出血指数呈正相关。结论　口腔是Hp的一个聚集地。

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种营养要求高，微需氧的革兰阴性细菌［1］。研究表明Hp是慢性活动性胃炎和胃十二指肠溃疡的主要病因，是胃癌发生的高危因子。但有关Hp的传播途径及传染源等尚未明了［2］。1989年Krajden等［3］从口腔中首次分离出Hp，此后多种方法应用于口腔中Hp的研究，但报道结果迥异。本研究依据Hp尿素酶C基因［4］和细胞毒素相关基因(cytotoxin-associated gene A，cagA)［5］设计引物，通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测取自多个牙位龈上、龈下菌斑中的Hp，旨在明确Hp是否存在于胃病及牙周炎患者的牙菌斑中、是否为cagA基因阳性的Hp菌株。

　　材料和方法

　　1.病例选择： 胃病组：主诉有上消化道症状、经北京医科大学肿瘤学院内镜室检查确诊为各种胃炎的胃病患者13例，男8例，女5例，年龄34～52岁，平均42岁，口腔检查均有牙龈炎或轻度牙周炎。牙周炎组：10例患者均选自北京医科大学口腔医学院牙周科门诊，均主诉无消化道症状，其中男5例，女5例，年龄26～52岁，平均40.7岁。两组患者均符合以下要求：①无其他系统性疾病；②3个月内未服用过抗生素及胃药；③12个月内未接受过牙周治疗；④全口牙不少于24颗。

　　2.取样和检查：从每例患者口腔内选择有牙龈炎症的6颗牙作为取样牙。以棉球隔湿，吹干后分别用消毒刮匙刮取龈上、龈下菌斑，即刻检查并记录牙周临床指数：菌斑指数(plaque index，PLI)、探诊深度(probing depth，PD)及出血指数(bleeding index，BI)。

　　3.提取DNA：按PCR试剂盒的要求快速提取菌斑样本中的DNA，将菌斑悬浮于100 μl样本处理液(BIO-RAD Co)中，56℃孵育30 min，高速震荡10 s后置100℃水浴8 min，再次高速震荡10 s，离心(12 000 r/min, 4 ℃)3 min。取上清用于PCR扩增。

　　4.PCR检测Hp: PCR试剂盒(Pacific Econ-Tech Co.U.S.A.）内含两对引物，预期扩增片段为294bp及400bp。20 μl反应体系含有两对引物各20 pmol/L，每种寡核苷酸4 mmol/L，DNA模板4μl，Taq DNA聚合酶2U及PCR缓冲液。反应在TMRobocycle gradient 40 型扩增仪（Stratagene公司）上进行。94 ℃预变性5 min，以94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min为1个循环，共计35个循环，最后1次循环72℃继续延伸7 min。以Hp标准株NCTC 11637(中国预防医学科学院陈晶晶教授惠赠)和1株Hp临床分离株（北京医科大学肿瘤学院）的DNA提取液分别作为阳性对照，采用PCR试剂盒内的阴性对照。用8％丙烯酰胺电泳鉴定PCR产物。为减少污染机会，DNA提取、PCR扩增及电泳分析分别在3个房间进行。

　　5.PCR敏感性和特异性试验：Hp纯培养72 小时，刮取菌落以生理盐水稀释，镜下计数测得菌液浓度。用样本处理液10倍系列稀释后使菌液每4μl含1、10、102、103、104及105个细菌，提取DNA用于PCR扩增。另外，提取牙龈卟啉菌、直弯曲菌、唾液链球菌、解脲类杆菌及大肠杆菌（均为国际标准株）的DNA，与被测样本同时进行PCR扩增。

　　结果

　　1.PCR方法的敏感性和特异性：本实验所用的PCR方法最少能检测到100个Hp细菌。扩增的上述5种其他细菌均为阴性，说明本方法敏感性和特异性较好。

　　2.牙周临床检查结果：胃病组的PD及BI均小于牙周炎组，胃病组分别为(2.76±0.98)mm及2.69±0.78，牙周炎组分别为 （5.74±1.42）mm及3.12±1.09，两组间比较P＜0.01，差异有极显著性。两组患者的PLI相近，胃病组为2.62±0.69, 牙周炎组为2.15±0.76，两组间比较P＞0.05，差异无显著性。

　　3.菌斑中的Hp检测：胃病组和牙周炎组菌斑中Hp的PCR检查结果见表1。胃病组中的11例及牙周炎组的全部患者均至少有1份菌斑样本中检出Hp，其中胃病组尿素酶C基因阳性率为28.8％（45/156），尿素酶C基因和cagA基因共同阳性率为3.2％（5/156），牙周炎组尿素酶C基因阳性率为49.2%（59/120），两种基因的共同阳性率为3.3％（4/120）。表2结果显示，龈下菌斑中Hp的检出率显著高于龈上菌斑(P＜0.01)。

　　4.Hp与牙周临床指标的相关关系：用Kendall-test分析Hp检出率与牙周临床指数的相关关系。在PD≥4mm的位点，菌斑中Hp检出率高于PD＜4mm的位点(P＜0.01)；而PD在4～5 mm处与大于6 mm处的龈下菌斑中，Hp检出率无明显差异(P＞0.05)。Hp的检出率与取样部位的BI明显相关(P＜0.05)。