摘要：目的初步探讨白假丝酵母菌（Candida albicans, C. albicans）侵袭口腔黏膜上皮细胞后细胞内灶性粘附激酶（Focal adhesion kinase, FAK）信息通路的改变情况。方法以Tca8113 细胞作为研究对象，用western blotting 的方法检测C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞后不同时间段细胞内液中磷酸化FAK 和总FAK 的改变。结果①在Tca8113 细胞中有微弱的总FAK 的表达，磷酸化FAK 则无表达；②磷酸化FAK 和总FAK 的表达在C. albicans刺激10min 后就有明显的升高，20min 达到最高峰，30min 失表达开始减弱，至120min 表达消失。结论第一次初步证实 C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞后早期可激活FAK 信息通路引起细胞的一系列改变。
　　关键词：白假丝酵母菌，灶性粘附激酶，口腔黏膜上皮细胞
　　白假丝酵母菌（Candida albicans, C. albicans）是人体中最常见的机会致病菌，研究者们对C. albicans 致病机制进行了大量的研究[1]，一致认为C. albicans 对宿主细胞的粘附是导致白假丝酵母菌病的第一步，也是最关键的一步[2]。对C. albicans 粘附机理的研究已经很深入，但C. albicans 粘附后宿主细胞内可能发生改变则未见报道。国外最近研究发现，微生物与宿主细胞粘附后可激活细胞内信号传导系统的改变[3]，而灶性粘附激酶（Focal adhesionkinase, FAK）信号系统是宿主细胞内多条信号传导通路的交汇点，可引起细胞的一系列生物学改变[4]。因此，本试验初步探讨了C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞后细胞内FAK 信号通路的变化。
　　1. 材料和方法
　　1.1 主要试剂
　　兔抗人 FAK 多克隆抗体和兔抗人磷酸化FAK 单克隆抗体（Cell signaling Technology），BCA 蛋白检测试剂盒（pierce）均购自上海吉泰生物公司。辣根酶过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG（Santa cruze）、牛血清白蛋白（BSA）（Sigma）， 购自北京中山生物公司产品。
　　1.2 白假丝酵母菌复苏和菌丝的诱导
　　白假丝酵母菌(ATCC 90028)，接种于沙堡氏培养基中进行复苏，选取单菌落转种于含10％小牛血清的DMEM 培养基中，在37℃含5％CO2 孵箱中孵育8 小时，直到C. albicans转变为菌丝型，1000×g、4℃离心10 分钟，弃上清，用DMEM 培养基重悬，调节C. albicans浓度至1×108。
　　1.3 口腔黏膜上皮细胞的复苏和培养
　　将本课题组保种的 Tca8113 细胞复苏在含10％小牛血清的DMEM 培养基中，将Tca8113细胞按1×104 接种于六孔板中，3ml/孔，待细胞达到90％单层融合时用于试验。
　　1.4 白假丝酵母菌感染口腔黏膜上皮细胞后细胞总蛋白的提取
　　将上述浓度的 C. albicans 刺激Tca8113 细胞，并于0min、10min、20min、30min、60min、120min 时用改良的RIPA 细胞裂解液裂解细胞提取细胞内液，所有过程均在冰上进行，12000×g、4℃离心20 分钟，收集上清，BCA 蛋白检测试剂盒检测提取蛋白的浓度，-80℃冻存备用。
　　为保证试验结果的可比性和可重复性，用于试验的C. albicans 和Tca8113 细胞均为同一代，且重复试验3 次。
　　1.5 Western blotting
　　在上述不同组及不同时间点的细胞内液中加入5×上样缓冲液，95℃，5min，然后按20ug/道蛋白量加样用于6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF 膜，5％脱脂奶粉封闭，室温1小时，加入FAK 抗体或磷酸化FAK 抗体（1:1000），4℃过夜，TBST 洗3×10min，加入二抗（1:5000）,室温1 小时，TBST 洗3×10min，TBS 洗10min，用ECL 显色，曝光，冲洗胶片。
　　1.6 结果分析
　　所有结果用伯乐公司的凝胶成像仪及 Quantity One4.1.1 分析软件进行分析，所有数据均经SPSS11.0 统计软件分析。
　　2. 结果与讨论
　　FAK 是由Hanks[5]和Schaller[6]在v-Src 转染的鸡胚细胞及正常细胞中被发现的，位于整合素密集的细胞粘附区，定位于8q24，分子量为125KD[7]。FAK 是一个多功能的非受体酪氨酸激酶，它在细胞间及细胞与细胞外基质粘附中发挥着关键作用，且与胚胎发育、细胞生存、周期调控、增殖、凋亡、迁移、转移及血管生成等密切相关[8]。
　　FAK 不是一种癌基因，但可在多种肿瘤细胞中呈高表达状态,而其激活形式——磷酸化FAK 则无表达，且FAK 的表达与肿瘤的浸润转移存在密切关系，抑制FAK 的表达可有效的降低肿瘤细胞的粘附和侵袭[9~11]。本试验结果也显示总FAK 在Tca8113 细胞中有较弱表达，而活化的FAK 即磷酸化FAK 在Tca8113 中无表达（0min 泳道），这与上述研究结果相一致。
　　C.albicans 是人体中最常见的机会致病菌，近来随着广谱抗生素的广泛应用以及免疫缺陷患者的日益增多，念珠菌的发病率及致死率均有上升趋势。因此，越来越多的研究者将目光集中在C.albicans 上，并对其致病的第一步也是最关键的一步——对宿主细胞的粘附进行了大量的研究，但研究多集中在Ca 或和宿主细胞表面粘附受体的结构或基因上，对二者相互作用过程中宿主细胞内信号通路的研究则极为罕见。C. albicans感染Tca8113 细胞后10min 即出现了磷酸化FAK 的表达，20min 时磷酸化FAK 表达达到最高峰，从30min 开始磷酸化FAK 的表达开始回落仍维持一段时间（至60min），至120min磷酸化FAK 表达消失。因此，本试验首次初步证实了在C. albicans 侵袭口腔黏膜上皮细胞过程的短期内（10min）即可引起细胞内FAK 信号通路的活化。
　　最近，阻断 FAK 功能的药物已被应用于临床治疗中[12~14]，相信本试验结果为治疗日益增多的C. albicans 感染可指出新的防治策略。

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