摘要：目的：探讨根面保留牙骨质对体外培养的人牙周韧带细胞表达牙骨质蛋白的影响，进一步揭示牙骨质的功能。材料和方法：选用因正畸拔除的牙齿，培养人牙周韧带细胞。将牙根纵劈为两半，去除牙髓组织。一半彻底刮除根面的牙骨质，暴露牙本质，作为对照组；另一半保留牙骨质，不暴露其下的牙本质，作为实验组。接种第二代牙周韧带细胞至根片表面，复合培养7 天后，收集根片上细胞和同样条件下接种在培养皿里细胞，提取RNA，real-timeRT-PCR 检测3 组细胞中牙骨质附着蛋白（CAP）和牙骨质蛋白23(CP-23) 基因表达情况，用β- actin 作为内参照。软件分析获取数据并进行t-检验。结果：人牙周韧带细胞在不同处理组中表达不同量的CP-23 和CAP，实验组均高于对照组，具有统计学意义（p<0.01）。结论：根面保留牙骨质促进人牙周韧带细胞牙骨质蛋白基因表达，提示根面保留牙骨质可能促进体外培养的人牙周韧带细胞向成牙骨质细胞方向分化。
　　关键词：牙骨质；牙周韧带细胞；牙骨质附着蛋白；牙骨质蛋白
　　0 引言
　　牙骨质是覆盖在牙根表面的薄层矿化结缔组织，近年研究表明牙骨质基质含有牙骨质附着蛋白（cementum attachment proteins,CAP）和牙骨质蛋白（cementum protein）,被认为是牙骨质特异性分子[1,2]。因此，牙骨质本身在促进牙周组织再生中的作用越来越受到重视。有研究表明根面保留牙骨质相比于牙骨质被完全刮除的根面，GTR 术中再生牙周组织的量明显增多[3]。然而，关于保留牙骨质促进牙周组织再生的机制尚未阐明。因此，本研究拟用人牙周韧带细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs），探讨根面保留的牙骨质对其分化的影响，进一步揭示牙骨质的功能，从而更好地发挥其在牙周组织再生中的作用。
　　1 材料
　　1.1 主要试剂
　　DMEM（Gibco,Gland Island, NY, USA）; 胎牛血清（Gibco，USA）;胰蛋白酶（Gibco，USA）; 青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司）;EDTA（华美生物工程公司）; Trizol：( 上海生工生物工程技术服务有限公司);cDNA 反转录试剂盒( 美国Fermentas 公司);LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I( 德国Roche Applied Science 公司)；PCR扩增试剂盒：宝物工程（大连）有限公司；DNA 分子质量标准（宝生物工程有限公司）；DEPC（美国Sigma 公司）；等。
　　1.2 主要仪器
　　恒温二氧化碳培养箱（Heraeus, USA）；台式离心机（Heraeus, USA）；倒置相差显微镜及照相系统（OLYMPUS CX71 , Japan）;超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);培养瓶、皿、48 孔板(Corning Incorporated, USA)；RM2135 切片机（LEICA Germany）；实时RT-PCR仪（德国Roche Applied Science 公司）；梯度PCR 仪（德国Biometra 公司）；Gene Quant pro紫外/可见光分光光度仪（美国Biochrom 有限公司）；等。
　　2 实验方法
　　2.1 人牙周韧带细胞的培养
　　取因正畸拔除的牙周健康的前磨牙，无菌条件下刮取牙根中1/3 的牙周膜组织，剪成1㎜×1 ㎜左右小块，接种于培养瓶底部，加入含有100U/ml 双抗和10﹪胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5% CO2，饱和湿度条件培养。当细胞长满培养瓶底80%时进行传代培养。
　　2.2 牙骨质根片和牙本质根片的制备
　　收集因正畸拔除的双尖牙，彻底刮除根面的牙周膜。釉牙骨质界下2 ㎜处去掉牙冠，将牙根纵劈为两半，去除牙髓组织。一半彻底刮除根面的牙骨质，暴露牙本质，作为对照组，记为PDLCs+D；另一半保留牙骨质，不暴露其下的牙本质，作为实验组，记为PDLCs+C。每组23 个根片。将制备好的根片放置在培养皿中，表面用EDTA 凝胶处理3 分钟。处理过的根面经三蒸水冲洗1 分钟后，浸泡在含双抗的PBS 溶液中过夜消毒。置48 孔板内，暴露的牙本质面或牙骨质面向上，大小约为7x5x1mm,每孔一个根片，待用。
　　2.3 hPDLCs 与根片复合培养
　　收集第二代 hPDLCs，制备1×106 个/ml 的细胞悬液。接种到48 孔板内的牙骨质片和牙本质片上，20μl/孔。在37℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中孵育2.5 小时后，每孔分别加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液0.5ml。将48 孔板放入细胞培养箱中静置培养，每隔3天换液一次。用倒置相差显微镜观察48 板底部细胞的生长情况。同时，将细胞按照2x104/cm2接种到直径3.5cm 的培养皿内，相同条件下进行培养，作为培养皿组，记为PDLCs 组。
　　2.4 CAP 和CP-23 基因表达检测
　　hPDLCs 与根片复合培养7 天后，用胰蛋白酶消化收集根片上的细胞，采用Trizol 法分别提取3 组细胞RNA，经浓度和纯度测定后，应用反转录试剂盒，将RNA 反转录成cDNA。反应条件为：37℃1h, 95℃ 5min。反转录生成的cDNA保存于-20℃备用，进行Real-time PCR。CAP 及CP-23 经BLAST 从基因库中获得，引物由上海博亚公司合成，以β-actin 作为内参照。Real-time PCR 反应采用LightCycler FastStart DNA Master SYBRGreen I。融解，分析产物特异性，电泳鉴定产物大小正确，结果用LightCycler Software 4.0LightCycler2.0 Roche 分析。以每组检测的mRNA 与β-actin mRNA 之比值表示CAP 和CP-23的基因表达量。提取的RNA 重复3 次实验，数据用均数±标准差表示，采用SPSS12.0 统计软件包，检验标准为α=0.05, 对数据进行方差分析。P<0.05 为有统计学意义。
　　3 实验结果
　　3.1 牙周韧带细胞培养
　　在组织块贴壁后7-10 天，显微镜下即可见细胞从组织块周边呈放射状或伪足状游出，开始游出的细胞在组织块周边零星分布，细胞多呈细长梭形或多角形，细胞核呈椭圆形、核仁明显。游出于组织块的细胞增殖速度快，细胞数目迅速增多，分裂相多见。
　　3.2 根片制备
　　每组取根片 2 个，经多聚甲醛固定，硝酸脱钙后，进行石蜡包埋，常规HE 染色。镜下观察显示PDLCs+D 组牙骨质暴露，未见牙骨质；而PDLCs+C 组根片保留一层牙骨质。组织学观察结果表明制备的牙骨质片和牙本质片达到实验要求。
　　3.3 real time RT-PCR
　　人牙周韧带细胞在不同处理组中表达不同量的CP-23 和CAP。对CP-23 的表达，牙骨质根片组显着高于牙本质根片组和培养皿组；而对于CAP 的表达，牙骨质根片组显着高于牙本质根片组，但低于培养皿组。
　　4 讨论
　　尽管牙骨质在解剖上属于牙齿的一部分，但在功能上却是牙周韧带纤维附着的位点，而且其形成和再生的细胞均来源于牙周韧带中的成牙骨质细胞。目前已从牙骨质基质中发现并提取了许多生长因子，研究表明这些生长因子对各种类型牙周韧带细胞具有重要的生物学作用[4,5]。其中CAP 和CP-23 被认为是牙骨质特异性蛋白，在牙骨质中的表达显着高于骨，而在牙本质中则无表达，而且被研究认为是牙周韧带中成牙骨质前体细胞的一个标志蛋白，能够促进牙周韧带细胞的生长和分化[1,2]。然而体内情况下，这些生长因子都是位于固态的矿化基质中的，这些被矿化基质所包裹的生长因子对细胞的作用如何，目前还未见有研究报道。因此，本研究中，利用原位保留的牙骨质微环境，经过EDTA 处理[6]，使表面脱矿，来研究脱矿的牙骨质基质对hPDLCs 表达CAP 和CP-23 的影响，从而探讨牙骨质基质成分是否对牙周韧带细胞向成牙骨质细胞方向分化产生影响。
　　我们的研究结果表明根面保留的牙骨质相比于牙本质表面，能够促进人牙周韧带成纤维细胞表达CP-23 和CAP。 提示牙骨质表面能够促进hPDLCs 向成牙骨质细胞方向分化。实验中，我们采用常温浸泡消毒的方法，尽量保存牙骨质和牙本质基质中的蛋白分子活性，两种不同表面处理的hPDLCs 表达不同量的CAP 和CP-23，表明可能是由于两种表面的基质构成不完全相同造成的。GONCALVES 等[7]研究了人根面牙骨质的特性，结果表明根面保留的牙骨质促进牙周缺损中矿化有关蛋白质的基因表达，包括骨涎蛋白、骨桥素等，从而认为保留牙骨质能够促进成牙骨质细胞方向分化。我们的研究结果与其一致。
　　本实验中，我们还检测了生长在培养皿中的PDLCs 表达CAP 和CP-23 的情况。结果表明生长在培养皿中的细胞相比于牙骨质片培养细胞，表达相对少量的CP-23，然而是相对较高量的CAP, 这可能是由于CAP 和CP-23 是独立表达的基因而非协同表达，从一定程度上表明细胞生长的微环境对其蛋白质基因表达有很大的影响。
　　微环境对细胞分化至关重要[8]。虽然牙骨质和牙本质都包含大量的多肽和信号分子，但是其量是不一样的。生长因子作用的特点存在剂量依赖性，因此，我们的结果可能是由于两种基质成分不同所造成的。其中CAP 和CP，牙骨质中的量显着高于牙本质[9]，在促分化过程中可能发挥了重要作用。其确切机制有待深入研究。
　　结论：根面保留牙骨质促进人牙周韧带细胞牙骨质蛋白基因表达，提示根面保留牙骨质可能促进体外培养的人牙周韧带细胞向成牙骨质细胞方向分化。
　　5 结论
　　我们的研究结果表明根面保留牙骨质能够促进人牙周韧带细胞牙骨质蛋白基因表达，提示根面保留牙骨质可能促进体外培养的人牙周韧带细胞向成牙骨质细胞方向分化。

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