体外牙髓干细胞定向分化为成牙本质样细胞的模型研究(2)
3.1.6 免疫荧光观察细胞微丝骨架
免疫荧光观察牙本质磨片和孔板上连续培养的牙髓干细胞的细胞微丝骨架。可见随着时间推移，牙本质磨片上细胞的微丝骨架结构逐渐改变。
在细胞接种的第1 天，镜下见牙本质磨片上细胞中的微丝纤细，均匀有序排列于整个胞体内部，微丝呈束状进入细胞的突起；对照组孔板上细胞接种的第1 天，微丝在细胞中的结构及分布与牙本质磨片上的细胞基本相似。
在接种的第2天，磨片上细胞的微丝结构变得明显，微丝束明显增粗，镜下可见清晰的微丝分隔，微丝呈纤维条索状沿细胞长轴分布，形成应力纤维。推测此时细胞内微丝结构发生重组，应力纤维生成增加，以适应牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中形态变化的需要。对照组孔板上的细胞相对而言胞内微丝表达弱于实验组，可见细胞内布满微丝，胞质荧光弱而均匀，边缘胞膜转折处呈明亮的绿线，但是应力纤维不明显。
在接种的第4天，细胞微丝逐渐呈密集趋势，对照组细胞内微丝成均匀分散排列，应力纤维较少。在接种的第8天，牙本质磨片上部分区域细胞逐渐密集，细胞内微丝聚集成一至两束应力纤维束，沿细胞长轴并行排列分布。与第4 天相比，应力纤维变得更长更聚集。对照组细胞增殖明显，但是细胞内应力纤维不明显，微丝在整个细胞内部均匀分布，构成成纤维细胞样或梭样外观。
3.2 MTT 检测细胞的增殖活性
MTT 检测各组细胞的光吸收值（OD 值），结果如表1。磨片组细胞在接种的1-6天缓慢增殖，8-10天增殖不明显，没有明显的对数生长期。相比之下，矿化液组细胞和磨片组的增殖曲线非常相。而培养基组细胞在1-3 天生长缓慢，在接种的第3-6 天进入对数生长期，细胞数量明显增多，在接种的6-10天，细胞增殖减慢，进入生长的平台期 。
SPSS 单因素方差分析表明，磨片组细胞的增殖活性明显小于培养基组细胞的增殖活性(p<0.05)，而与矿化液组细胞之间的增殖活性无显着性差异（p>0.05）。
3.3 三组细胞碱性磷酸酶活性的检测
检测各组细胞碱性磷酸酶活性。在接种的第1 天，三组细胞的ALP 活性十分接近。第3-10 天，矿化液组和磨片组细胞的ALP 活性明显增加。在接种的第10 天矿化液组细胞ALP 活性进入平台期，磨片组细胞的ALP 活性呈下降趋势。相对而言，培养基组的细胞在3-10 天ALP 活性无明显增加。
SPSS 单因素方差分析表明，在培养的1-3 天，各组细胞的ALP 活性无显着差异(p>0.05)；但在培养的第6-10 天，磨片组细胞的ALP 活性明显高于培养基组细胞的ALP 活性 (p<0.05),而与矿化液组细胞的ALP 活性之间无显着性差异(p>0.05)。
4．讨论
研究表明，牙髓干细胞表达CD34，CD44，STRO-1，CD146，3G5 等特异性标记物[9-10,18-19]，在本实验中，分别对第4 代和第8 代牙髓细胞进行CD34 和CD45 免疫组化染色，结果显示， CD34 表达（+），CD45 表达（-），说明在培养的牙髓细胞中有牙髓干细胞存在，并且在细胞传代的过程中，始终有一定数量的牙髓干细胞存在。
扫描电镜显示，牙本质磨片上可见诱导后的牙髓干细胞形成细胞突起伸入牙本质小管，但是细胞没有典型的成牙本质细胞形态；同时，牙本质磨片上也可见到偏极化生长的成牙本质样细胞，但是其突起没有伸入小管，这与体内成牙本质细胞也不相同。但与体外培养的永生化成牙本质细胞Mo6-G3 [20]相比,细胞在形态上相似。另外，牙髓干细胞在牙本质磨片上接种仅4 天即形成复层生长，而接种在玻片上的牙髓干细胞在第8 天尚未形成复层生长，王凤明[26]等则对牙髓细胞进行体外连续培养3 周才能形成复层生长，说明牙本质磨片的三维结构能够起到物理信号的诱导作用，具有明显的促进牙髓干细胞形成复层生长的能力。有学者以多孔磷酸三钙为支架接种细胞 [21]，与其相比，接种于磨片上的细胞更密集，更易于产生细胞间的相互作用从而形成复层生长。细胞间的相互作用同样是组织工程信号的一种，对于牙髓牙本质组织工程具有重要的作用。
微丝（actin filament），是细胞骨架的一种，在细胞内成束状、网状或纤维状散在分布。非肌细胞的微丝在大多数情况下是一种动态结构,未组装的肌动蛋白与微丝在胞内可以随时组装和解聚以不同的结构形式来适应细胞活动的需要。在接种于牙本质磨片的第1 天，微丝稀疏均匀分布于细胞内，结合扫描电镜观察磨片上生长的牙髓干细胞可知，此时细胞刚好完成贴壁，推测此时牙髓干细胞尚未对磨片的诱导分化作用作出应答。接种的第2 天，细胞微丝增粗，出现明显的应力纤维，此时扫描电镜可观察到磨片上的细胞有成牙本质细胞样突起形成，并有部分细胞的突起伸入牙本质小管，推测此时，牙髓干细胞受到牙本质磨片的诱导，发生形态的变化。为了适应突起形成的需要，微丝的合成迅速增加并向突起方向聚拢推动膜的运动。随着培养时间的进一步增加，生长在磨片上的细胞内微丝逐渐收拢成束，部分细胞可见伸长的应力纤维形成单极突起，沿细胞长轴并行排列，这与Mesgouez C[20]等用免疫荧光对永生化成牙本质细胞MO6-G3 的微丝结构进行研究时结果一致。而对照组细胞则无明显的应力纤维束形成，仅显示为均匀散在分布。与Wang FM 等[21]接种在多孔磷酸钙盐材料上的细胞微丝骨架相比，牙本质磨片上细胞中的应力纤维更明显。
关于牙髓干细胞在牙本质磨片上的增殖活性，有学者[16,17]认为牙髓干细胞在磨片上几乎不增殖。也有人[22]认为细胞在牙本质磨片上的增殖率与在培养板上没有差别。然而，尚没有相关实验对此作出进一步检测。在本实验中，加入矿化液后，牙髓干细胞的增殖活性明显减弱，说明在矿化液的诱导下，牙髓干细胞出现向成牙本质细胞分化。而牙髓干细胞在磨片上的增殖率明显低于接种24 孔板的牙髓干细胞，与接种在矿化液中的细胞相似，推测牙本质磨片能够诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，从而使细胞增殖的能力减弱。
为了进一步证实牙本质磨片具有诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的能力，我们检测了接种在牙本质磨片上的牙髓干细胞的ALP 的活性。ALP 是反映牙髓干细胞生物学特性的关键酶，是牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的前提，在牙齿的矿化过程中具有重要的作用。ALP 活性增强，被认为是牙髓干细胞向成牙本质细胞分化和牙本质形成的早期标志[22-25]。因此，我们采用ALP 作为判断牙髓干细胞是否向成牙本质样细胞分化的指标。本实验中，对三种不同培养条件下的牙髓干细胞进行ALP 活性检测，结果表明在培养基组的牙髓干细胞中ALP 活性轻度表达，随着培养时间的增长，ALP 的活性会轻度增高。而培养在成牙本质样细胞分化模型中的牙髓干细胞的ALP 活性增加明显，与培养在矿化液中的牙髓干细胞的ALP 活性无统计学差异。这说明以牙本质磨片为支架的成牙本质样细胞分化模型与矿化液在诱导细胞矿化上具有相似的作用，能够诱导牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化。这一结论符合MTT 的检测结果，同时也支持了实验一中关于成牙本质样细胞分化模型促牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的推论。
牙本质磨片中含有发育时分泌在牙本质中的TGFβs，IGF,BMPs 等各种生长因子和难溶性胞外基质，这些生长因子和基质能够在一定的条件下被释放而对细胞产生诱导作用，由于本实验中采用杀菌效能强大的次氯酸钠对牙本质磨片进行了30 分钟的预处理，所以磨片本身具有的生长因子已基本失去活性，因此我们认为牙髓干细胞定向分化为成牙本质细胞主要源于牙本质磨片的三维物理环境，至于牙本质磨片中生长因子及胞外基质对细胞分化的影响尚需进一步研究。
5．总结
牙本质磨片能够从形态和功能两方面对牙髓干细胞的分化提供重要的诱导作用，使牙髓干细胞表现出成牙本质细胞的形态学特征，增殖活性减弱，微丝重组，碱性磷酸酶活性增强。以牙髓干细胞为种子细胞，以牙本质磨片为支架构建的成牙本质样细胞分化模型为研究成牙本质细胞的分化机制和牙髓牙本质复合体的再生提供了新的思路和选择。
参考文献
[1] Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin–Ike T, et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dentalpulp-derived fibroblasts[J]. Arch Oral Biol,1992,37:1045–1055
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[19]Suchánek J, Soukup T, Ivancaková R,et al. Human dental pulp stem cells-isolation and long term cultivation[J].
Acta Medica (Hradec Kralove),2007,50(3):195-201.
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[22]Schmalz G, Schuster U, Thonemann B,et al. Dentin barrier test with transfected bovine pulp-derived cells[J]. JEndod, 2001, 27(2):96-102.
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[24]Yokose S,Kadokura H,Tajima Y,et a1.Establishment and characterization of a culture system forenzymatically released rat dental pulp cells[J]．Calcif Tissue Int,2000,66(2):139-144.
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[26]Wang FM, Hu T,Zhou XD Study on Enzymatically Released Human Dental Pulp Cells with Collagenase I invitro[J].J Sichuan Uni, 2005,36(6):877-879[27]Magloire H, Romeas A, Melin M,et al. Molecular regulation of odontoblast activity under dentin injury[J].Adv Dent Res, 2001,15:46-50.
免疫荧光观察牙本质磨片和孔板上连续培养的牙髓干细胞的细胞微丝骨架。可见随着时间推移，牙本质磨片上细胞的微丝骨架结构逐渐改变。
在细胞接种的第1 天，镜下见牙本质磨片上细胞中的微丝纤细，均匀有序排列于整个胞体内部，微丝呈束状进入细胞的突起；对照组孔板上细胞接种的第1 天，微丝在细胞中的结构及分布与牙本质磨片上的细胞基本相似。
在接种的第2天，磨片上细胞的微丝结构变得明显，微丝束明显增粗，镜下可见清晰的微丝分隔，微丝呈纤维条索状沿细胞长轴分布，形成应力纤维。推测此时细胞内微丝结构发生重组，应力纤维生成增加，以适应牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中形态变化的需要。对照组孔板上的细胞相对而言胞内微丝表达弱于实验组，可见细胞内布满微丝，胞质荧光弱而均匀，边缘胞膜转折处呈明亮的绿线，但是应力纤维不明显。
在接种的第4天，细胞微丝逐渐呈密集趋势，对照组细胞内微丝成均匀分散排列，应力纤维较少。在接种的第8天，牙本质磨片上部分区域细胞逐渐密集，细胞内微丝聚集成一至两束应力纤维束，沿细胞长轴并行排列分布。与第4 天相比，应力纤维变得更长更聚集。对照组细胞增殖明显，但是细胞内应力纤维不明显，微丝在整个细胞内部均匀分布，构成成纤维细胞样或梭样外观。
3.2 MTT 检测细胞的增殖活性
MTT 检测各组细胞的光吸收值（OD 值），结果如表1。磨片组细胞在接种的1-6天缓慢增殖，8-10天增殖不明显，没有明显的对数生长期。相比之下，矿化液组细胞和磨片组的增殖曲线非常相。而培养基组细胞在1-3 天生长缓慢，在接种的第3-6 天进入对数生长期，细胞数量明显增多，在接种的6-10天，细胞增殖减慢，进入生长的平台期 。
SPSS 单因素方差分析表明，磨片组细胞的增殖活性明显小于培养基组细胞的增殖活性(p<0.05)，而与矿化液组细胞之间的增殖活性无显着性差异（p>0.05）。
3.3 三组细胞碱性磷酸酶活性的检测
检测各组细胞碱性磷酸酶活性。在接种的第1 天，三组细胞的ALP 活性十分接近。第3-10 天，矿化液组和磨片组细胞的ALP 活性明显增加。在接种的第10 天矿化液组细胞ALP 活性进入平台期，磨片组细胞的ALP 活性呈下降趋势。相对而言，培养基组的细胞在3-10 天ALP 活性无明显增加。
SPSS 单因素方差分析表明，在培养的1-3 天，各组细胞的ALP 活性无显着差异(p>0.05)；但在培养的第6-10 天，磨片组细胞的ALP 活性明显高于培养基组细胞的ALP 活性 (p<0.05),而与矿化液组细胞的ALP 活性之间无显着性差异(p>0.05)。
4．讨论
研究表明，牙髓干细胞表达CD34，CD44，STRO-1，CD146，3G5 等特异性标记物[9-10,18-19]，在本实验中，分别对第4 代和第8 代牙髓细胞进行CD34 和CD45 免疫组化染色，结果显示， CD34 表达（+），CD45 表达（-），说明在培养的牙髓细胞中有牙髓干细胞存在，并且在细胞传代的过程中，始终有一定数量的牙髓干细胞存在。
扫描电镜显示，牙本质磨片上可见诱导后的牙髓干细胞形成细胞突起伸入牙本质小管，但是细胞没有典型的成牙本质细胞形态；同时，牙本质磨片上也可见到偏极化生长的成牙本质样细胞，但是其突起没有伸入小管，这与体内成牙本质细胞也不相同。但与体外培养的永生化成牙本质细胞Mo6-G3 [20]相比,细胞在形态上相似。另外，牙髓干细胞在牙本质磨片上接种仅4 天即形成复层生长，而接种在玻片上的牙髓干细胞在第8 天尚未形成复层生长，王凤明[26]等则对牙髓细胞进行体外连续培养3 周才能形成复层生长，说明牙本质磨片的三维结构能够起到物理信号的诱导作用，具有明显的促进牙髓干细胞形成复层生长的能力。有学者以多孔磷酸三钙为支架接种细胞 [21]，与其相比，接种于磨片上的细胞更密集，更易于产生细胞间的相互作用从而形成复层生长。细胞间的相互作用同样是组织工程信号的一种，对于牙髓牙本质组织工程具有重要的作用。
微丝（actin filament），是细胞骨架的一种，在细胞内成束状、网状或纤维状散在分布。非肌细胞的微丝在大多数情况下是一种动态结构,未组装的肌动蛋白与微丝在胞内可以随时组装和解聚以不同的结构形式来适应细胞活动的需要。在接种于牙本质磨片的第1 天，微丝稀疏均匀分布于细胞内，结合扫描电镜观察磨片上生长的牙髓干细胞可知，此时细胞刚好完成贴壁，推测此时牙髓干细胞尚未对磨片的诱导分化作用作出应答。接种的第2 天，细胞微丝增粗，出现明显的应力纤维，此时扫描电镜可观察到磨片上的细胞有成牙本质细胞样突起形成，并有部分细胞的突起伸入牙本质小管，推测此时，牙髓干细胞受到牙本质磨片的诱导，发生形态的变化。为了适应突起形成的需要，微丝的合成迅速增加并向突起方向聚拢推动膜的运动。随着培养时间的进一步增加，生长在磨片上的细胞内微丝逐渐收拢成束，部分细胞可见伸长的应力纤维形成单极突起，沿细胞长轴并行排列，这与Mesgouez C[20]等用免疫荧光对永生化成牙本质细胞MO6-G3 的微丝结构进行研究时结果一致。而对照组细胞则无明显的应力纤维束形成，仅显示为均匀散在分布。与Wang FM 等[21]接种在多孔磷酸钙盐材料上的细胞微丝骨架相比，牙本质磨片上细胞中的应力纤维更明显。
关于牙髓干细胞在牙本质磨片上的增殖活性，有学者[16,17]认为牙髓干细胞在磨片上几乎不增殖。也有人[22]认为细胞在牙本质磨片上的增殖率与在培养板上没有差别。然而，尚没有相关实验对此作出进一步检测。在本实验中，加入矿化液后，牙髓干细胞的增殖活性明显减弱，说明在矿化液的诱导下，牙髓干细胞出现向成牙本质细胞分化。而牙髓干细胞在磨片上的增殖率明显低于接种24 孔板的牙髓干细胞，与接种在矿化液中的细胞相似，推测牙本质磨片能够诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，从而使细胞增殖的能力减弱。
为了进一步证实牙本质磨片具有诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的能力，我们检测了接种在牙本质磨片上的牙髓干细胞的ALP 的活性。ALP 是反映牙髓干细胞生物学特性的关键酶，是牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的前提，在牙齿的矿化过程中具有重要的作用。ALP 活性增强，被认为是牙髓干细胞向成牙本质细胞分化和牙本质形成的早期标志[22-25]。因此，我们采用ALP 作为判断牙髓干细胞是否向成牙本质样细胞分化的指标。本实验中，对三种不同培养条件下的牙髓干细胞进行ALP 活性检测，结果表明在培养基组的牙髓干细胞中ALP 活性轻度表达，随着培养时间的增长，ALP 的活性会轻度增高。而培养在成牙本质样细胞分化模型中的牙髓干细胞的ALP 活性增加明显，与培养在矿化液中的牙髓干细胞的ALP 活性无统计学差异。这说明以牙本质磨片为支架的成牙本质样细胞分化模型与矿化液在诱导细胞矿化上具有相似的作用，能够诱导牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化。这一结论符合MTT 的检测结果，同时也支持了实验一中关于成牙本质样细胞分化模型促牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的推论。
牙本质磨片中含有发育时分泌在牙本质中的TGFβs，IGF,BMPs 等各种生长因子和难溶性胞外基质，这些生长因子和基质能够在一定的条件下被释放而对细胞产生诱导作用，由于本实验中采用杀菌效能强大的次氯酸钠对牙本质磨片进行了30 分钟的预处理，所以磨片本身具有的生长因子已基本失去活性，因此我们认为牙髓干细胞定向分化为成牙本质细胞主要源于牙本质磨片的三维物理环境，至于牙本质磨片中生长因子及胞外基质对细胞分化的影响尚需进一步研究。
5．总结
牙本质磨片能够从形态和功能两方面对牙髓干细胞的分化提供重要的诱导作用，使牙髓干细胞表现出成牙本质细胞的形态学特征，增殖活性减弱，微丝重组，碱性磷酸酶活性增强。以牙髓干细胞为种子细胞，以牙本质磨片为支架构建的成牙本质样细胞分化模型为研究成牙本质细胞的分化机制和牙髓牙本质复合体的再生提供了新的思路和选择。
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