组织病理资讯中心 Topics
MBA对粘液表皮样癌P53蛋白表达和细胞增殖周期的影响
作者:佚名 日期:2007年08月16日 来源:本站原创 浏览:

核心提示:
摘要 目的:研究六亚甲基二乙酰胺(HMBA)诱导人粘液表皮样癌(MEC-1)细胞分化与细胞P53蛋白表达和细胞增殖周期的关系。方法:MTT比色法测定HMBA对MEC-1细胞体外生长的作用;Feulgen染色测定细胞DNA含量;ABC免疫酶染色检测P53蛋白;FCM法测定细胞增殖周期。结果:HMBA对MEC-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性;HMBA诱导的细胞与对照细胞比较,DNA含量减少,P53蛋白水平降低,G1期细胞数增加和S期细胞数减少。结论:HMBA对MEC-1细胞的诱导分化作用与其调节P53基因蛋白表达和细胞增殖周期有关。

Effects of Hexamethylene Bisacetamide

  on P53 Protein Expression of MEC-1 Cell Line and Cell Differentiation

Liu Bin, Situ Zhenqiang, Wu Junzheng, et al

  College of Stomatology, the Fourth Military Medical University

  Abstract Objective:To investigate the relationship between the differentiation of the mucoepidermoid carcinoma cell line MEC-1 induced by HMBA and the expression of P53 protein.Methods: Effects of HMBA on the growth of MEC-1 cells in vitro were measured with MTT colorimetric assay, and the content of DNA in cells was assayed by using Feulgen's staining. The P53 protein expression of MEC-1 cells was detected with ABC immunohistochemistry with anti-mutant P53 protein antibody, and the distribution of cells in different differentiation phase was determined by flow cytometry.Results: HMBA inhibited the growth of MEC-1 cells in a dose-dependant and time-dependant manner, and HMBA-treated MEC-1 cells were arrested in the G1 phase and had a lower content of DNA and a lower level of P53 protein compared with the control group.Conclusion:The differentiation of MEC-1 cells induced by HMBA may be associated with the regulation of HMBA on the P53 protein expression and the cell differentiation cycle.

  Key words: mucoepidermoid carcinoma HMBA P53 protein cell differentiation cycle

  作者以往对低分化型粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)来源的MEC-1细胞系的分化诱导研究表明,分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,HMBA)对体外培养的以及裸鼠体内移植的MEC-1细胞均有显著的生长抑制作用和分化诱导作用[1,2]。目前,对HMBA的分化诱导作用机理尚不十分清楚。本实验旨在探讨MEC-1细胞的分化与P53抑癌基因蛋白表达和细胞周期的相互关系。

  1 材料和方法

  1.1 分化诱导剂配制及细胞培养

  HMBA(Sigma,美国)配制成0.5 mol/L母液,用培养液稀释至所需浓度。人粘液表皮样癌MEC-1细胞系(第四军医大学口腔生物学教研室建立)用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(GIBCO,美国),在37 ℃、5% CO2及100%湿度条件下培养。用MTT比色法[3]测定HMBA以不同浓度、不同时间和不同方式对MEC-1细胞体外生长的细胞存活分数的影响。

  1.2 Feulgen染色

  MEC-1细胞培养在含1 mmol/L的HMBA培养液或对照培养液中,4天后,取细胞铺片,按常规Feulgen染色法显示细胞核DNA,用图像分析仪定量分析其相对含量,每个样本分析100个细胞,用t检验进行统计处理。

  1.3 ABC免疫酶染色

  细胞处理及标本制备同1.2节。用鼠抗人突变型P53抑癌基因蛋白抗体(北京中山生物技术公司)及ABC试剂盒(Vector公司,美国),按常规ABC法染色,标本分析同1.2节。

  1.4 流式细胞术(FCM)

  实验分3组,加药组MEC-1细胞用1 mmol/L或4 mmol/L的HMBA体外诱导培养48小时;去药组细胞用1 mmol/L或4 mmol/L的HMBA体外诱导培养96小时,更换无药培养液培养48小时;对照组用无药培养液培养。分别用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA(1∶1)消化细胞,制备单个细胞悬液,70%冷乙醇固定,PBS洗涤,再用1% Triton X-100、0.01% RNase和0.05%PI处理,通过300目尼龙网备检。用ProfileⅡ型流式细胞仪,在488 nm激发波长下测定细胞DNA,用Multicycle软件分析细胞周期分布情况。

  2 结 果

  2.1 HMBA对MEC-1细胞生长的影响

  用MTT比色法测定的结果见图1。HMBA在1 mmol/L对MEC-1细胞作用2天后开始产生抑制作用,并随着浓度增加和作用时间延长生长抑制作用更明显。在HMBA作用4天后再去药培养,MEC-1细胞逐渐恢复增殖。表明HMBA对MEC-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性,并具有一定的可逆性。

MBA对粘液表皮样癌P53蛋白表达和细胞增殖周期的影响

1 HMBA对MEC-1细胞生长的影响

  HMBA组 ○ 1mol/L,△ 2 mol/L,□ 4 mol/L

  去除HMBA组 ● 1 mol/L,▲ 2 mol/L,■ 4 mol/L

  2.2 HMBA对MEC-1细胞DNA含量及P53蛋白表达的影响

  Feulgen染色标本用图像分析仪分析结果显示,MEC-1细胞在1 mmol/L的HMBA诱导4天后,细胞核平均DNA含量显著下降(表1)。

表1 HMBA对MEC-1细胞DNA及P53

  蛋白水平的影响

分组 DNA(MBA对粘液表皮样癌P53蛋白表达和细胞增殖周期的影响) P53(MBA对粘液表皮样癌P53蛋白表达和细胞增殖周期的影响) P53阳性率(%)
对照组 183.42±6.73 183.70±8.60 16.31
HMBA组 175.54±3.91 175.72±6.00 9.71

P<0.05

  P53抗体染色标本用图像分析仪分析结果显示,MEC-1细胞在1 mmol/L的HMBA诱导4天后,细胞抑癌基因P53蛋白水平显著下降(表1)。

  2.3 HMBA对MEC-1细胞系细胞增殖周期的影响

  HMBA诱导48小时后,处于S期的MEC-1细胞比例下降、G1期比例升高,并呈剂量依赖性。HMBA诱导96小时后去药培养48小时,MEC-1细胞各时相比例有所恢复(表2)。

表2 HMBA对MEC-1细胞细胞增殖周期的影响(%)

分 组 细胞周期各时相比例
G1期 S期

G2期

对照组 63.2 20.1 16.7
HMBA组1 mmol/L 67.1 17.6 13.0
 4 mmol/L 83.5 4.0 12.5
去除HMBA组1 mmol/L 65.7 21.7 13.0
     4 mmol/L 65.7 11.7 22.6

  3 讨 论

  研究表明,许多肿瘤细胞在极性分化诱导剂的作用下降低增殖能力并发生成熟分化[4]。HMBA是一种有效的分化诱导剂,对低分化型粘液表皮样癌来源的MEC-1细胞系具有显著的分化诱导作用[1,2]。本实验着重探讨抑癌基因P53蛋白和细胞周期与MEC-1细胞分化的关系,结果表明,在HMBA的诱导分化作用下,MEC-1细胞增殖能力降低、DNA含量减少、P53蛋白水平下降,同时细胞阻止于G1期。

  文献报道[5],P53蛋白是一种由p53抑癌基因编码的53 kD核磷酸化蛋白。野生型p53基因及其产物在维持正常细胞生长、抑制恶性增殖过程中起着重要作用。野生型P53蛋白对细胞由G1期进入S期的转变具重要作用,对细胞增殖有调控作用。如果野生型P53蛋白缺少或突变型P53蛋白过度表达,则G1到S期不受抑制,致使细胞增殖。在许多类型的人肿瘤中已发现突变型P53蛋白的过度表达。本实验发现,HMBA可使MEC-1细胞增殖受阻于G1期,DNA合成受抑制,同时突变型P53蛋白水平下降,提示HMBA有可能通过调控突变型P53蛋白而影响细胞周期,进而抑制细胞增殖。

  细胞周期变化与细胞分化关系密切。本实验发现,MEC-1细胞在HMBA诱导分化作用下,细胞生长抑制,同时细胞阻止于G1期;当去除HMBA的作用,细胞恢复增殖,G1期细胞数减少,S期和G2期细胞数增加,表明HMBA调控细胞周期与MEC-1细胞分化有密切的关系。Kiyokawa等[6]报道,HMBA对鼠红白血病细胞的分化诱导作用与细胞G1期延长及细胞周期进程调节因子有关。用特异性细胞周期抑制剂阻止MELC于G1期并不引起细胞终末分化,但HMBA可使细胞阻止于G1期,并诱导终末分化。HMBA抑制细胞周期进程涉及到HMBA增加未磷酸化抑癌基因pRB蛋白的累积,降低细胞周期素A(Cyclin A)蛋白的水平[6],抑制Cyclin依赖型激酶4(cdk4)的活性[7],以及调控与细胞周期相关的两套信号系统(上调cAMP-PKA信号系统,下调DAG-PKC信号系统)[8]

  综上分析,HMBA的分化诱导机制复杂,影响因素多,癌细胞受阻于G1期是启动分化的先决条件,P53蛋白是重要的调控因子之一。

本课题为国家自然科学基金资助课题(编号 39270721)

  参考文献

  1 陈宇萍,司徒镇强,吴军正,等.人粘液表皮样癌MEC-1细胞HMBA诱导分化的研究.中华口腔医学杂志,1996,31(1):28~30

  2 贾保军,司徒镇强,吴军正,等.六亚甲基二乙酰胺对MEC-1细胞裸鼠移植瘤的诱导分化作用.中华口腔医学杂志,1996,31(2):85~87

  3 吴军正,司徒镇强,刘 斌,等.MTT试验及其在抗癌中药筛选中的应用.中华口腔医学杂志,1992,27(6):373~375

  4 Beere HM, Hickman JA. Differentiation: a suitable strategy for cancer chemotherapy?. Anti-cancer Drug Edsign, 1993, 8(4):299~322

  5 李士谔.细胞分化在致癌和抑癌中的作用.中国医学科学院学报,1994,16(1):73~77

  6 Kiyokawa H, Richon VM, Venta-Perez G, et al. Hexame-thylene bisacetamide-induced erythroleukemia cell differentiation involes modulation of events required for cell cycle progreesion through Gl. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(14):6746~6750

  7 Kiyokawa H, Rchons VM, Rifkind RA, et al. Suppression of cyclin-dependent kinase 4 during induced differentiation of erythroleucemia cells. Mol Cell Biol, 1994, 14(11):7195~7203

  8 谷善青,梁云燕,王跃民,等.环六亚甲基双乙酰胺对胃癌不同细胞周期两条信号系统的调节.生物化学与生物物理进展,1997,24(5):443~446

相关阅读:

    上一篇文章:口腔病理学实验课的应用优势
    下一篇文章:腮腺组织学特点
    0% (0)
    0% (10)
    发表评论
    用户评论
     以下是对 [MBA对粘液表皮样癌P53蛋白表达和细胞增殖周期的影响] 的评论,总共:条评论
    关于我们广告业务联系我们版权说明网站地图
    Copyright 2005 - kqqy.com All Rights Reserved
    友情链接: 口腔医学网 | 牙周炎 | 口 腔挂图 | 牙齿矫正 |