摘　要：目的： 研究舌部鳞状细胞癌的细胞系以及根据不同的分化程度和是否有淋巴结转移来分类的舌癌组织中细胞周期蛋白D（cyclin D）的基因转录和蛋白合成情况。方法：应用免疫组织化学ABC法检测cyclin D蛋白合成；原位杂交技术检测cyclin D 基因的转录。结果：①cyclin D单克隆抗体标记后，经免疫组织化学染色78.6%(33/42)显示cyclin D蛋白过度表达；②cyclin D探针随机引物标记，经原位杂交后显示，cyclin D mRNA的阳性表达率为66.7%(28/42)；③cyclin D的表达与是否有淋巴结的转移有相关性，12例有转移的舌癌组织中通过免疫组织化学染色和原位杂交染色后分别有10例(83.3%)和9例(75%)有cyclin D的表达，而在30例无淋巴结转移的舌癌组织中，分别仅有13例(43.3%)和11例(36.7%

　　无限增殖是恶性肿瘤细胞的基本特征，大量的研究结果证明，肿瘤细胞的细胞周期调控机制发生了改变， D型cyclins被认为是限制G1期进程最重要的调控因子。人们经过研究，相继发现它与许多人类的肿瘤有关，在B细胞淋巴瘤^〔1〕、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈部鳞癌^〔2〕、胃肠癌、食道癌^〔3〕中都证明有cyclin D1基因的过度表达。口腔鳞状细胞癌约占口腔颌面部恶性肿瘤的80％，是口腔颌面部的主要肿瘤之一，并随着年龄的增长其发病率增高。本实验选用舌癌组织及细胞系进行cyclin D基因转录与蛋白合成的研究，观察舌癌与cyclin D的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本

　　42例舌部鳞状细胞癌组织取自我院近5年手术切除标本，所有标本均经体积分数为10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片后苏木精－伊红（HE）染色，进行病理诊断及分类。高度分化舌癌21例，中度分化舌癌13例，低度分化舌癌8例，其中30例无淋巴结转移，12例伴有淋巴结转移。

　　1.2　细胞系

　　舌癌细胞系（Tca8113）由何荣根等建立，本院生物学教研室冻存提供。将冻存的Tca8113细胞于37 ℃水浴中快速复苏，接种于含体积分数为10%灭活胎牛血清，10⁵IU/L青霉素的RPMI1640培养液中，置37 ℃，CO₂孵箱内培养。

　　1.3　细胞爬片的制备

　　将经清洁液处理、消毒后的盖玻片置于6孔板中，加入10⁴/ml浓度含Tca8113贴壁生长细胞的完全培养基悬液，37 ℃，CO₂孵箱内培养48 h，弃液，用10 mmol/L pH7.4 PBS洗3次，在PBS配制的40 g/L多聚甲醛中固定30 min，逐级脱水后风干，-20 ℃保存备用。

　　1.4　抗体和探针

　　羊抗鼠cyclin D单克隆抗体由福州迈新公司提供。插入有cyclin D全长 cDNA的pBS-cyclin D质粒由美国Hunter T博士惠赠。

　　1.5　免疫组织化学染色检测蛋白合成

　　常规ABC免疫组化染色法，ABC试剂盒购自Vector公司。主要步骤如下：切片常规脱蜡；枸橼酸微波处理修复抗原；羊血清封闭；一抗（工作浓度1∶30）湿盒中4 ℃过夜；生物素化羊抗鼠IgG室温30 min；ABC复合物室温30 min；DAB显色，苏木精复染，透明，封片。用PBS代替第一抗体作为空白对照。用已知阳性的乳腺癌作为阳性对照。

　　1.6　组织/细胞原位杂交检测基因转录　碱裂解法小量提取pBS-cyclin D质粒，经Not I和 Hind III双酶切后获得约1.3 Kb的全长cyclin D cDNA。DIG标记与检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，探针标记、预杂交及杂交后检测程序均按照该试剂盒说明进行。杂交时设不加探针和不加抗地高辛抗体的对照组，作为阴性对照。

　　1.7　结果判定

　　根据阳性细胞的着色强度分为3个等级，弱阳性（+）即阳性细胞数小于15%，阳性（++）即阳性细胞数在15～65%之间，强阳性（+++）即阳性细胞数大于65%。