摘要：目的 对大鼠牙周病与正常牙正畸移动中整合素β3mRNA表达变化进行研究。 方法 用原位杂交方法检测牙周病与正常牙正畸移动后β3mRNA转录水平的变化。结果 正常牙与牙周炎牙移动后12小时与3天后，牙周膜内破骨细胞整合素β3 mRNA有阳性表达，但表达较弱。在牙槽骨内的骨髓腔内有大量细胞有整合素β3 mRNA的阳性表达，且表达较强。结论 在正常牙移动及牙周炎牙移动中，整合素β3参与破骨细胞前体向破骨细胞转化及破骨细胞迁移和粘附。
　　关键词：整合素 整合素β3破骨细胞
　　1. 引言
　　破骨细胞表达的β3组整合素αvβ3是破骨细胞表达水平最强的整合素，是其主要粘附分子。破骨细胞整合素αvβ3配体为 VN，其介导的细胞粘附与破骨细胞的迁移分化及其与骨基质的粘附有密切关系[1]。
　　在牙周炎和正畸牙移动中，破骨细胞是骨吸收的核心细胞。破骨细胞整合素β3的表达是否参与了牙槽骨的改建和吸收？本实验用原位杂交方法探测整合素β3 mRNA转录水平的变化，对牙周炎与牙移动中牙周组织与整合素表达的关系进行探讨。
　　2. 材料与方法
　　2.1 实验设计
　　选用10周龄雄性成年SD大鼠96只（体重350g±，四川大学华西实验动物中心提供）随机分为正常牙加力组、牙周炎牙加力组。牙周炎牙齿模型在缝线缝扎和高糖饮食一个月后获得[2]。牙齿加力方法为：用结扎丝将NiTi螺旋弹簧的一端结扎于磨牙颈部，弹簧的另一端结扎于两个切牙上并用粘结剂固定，使弹簧拉伸，力量为50g，使磨牙受到近中方向的拉力，形成大鼠磨牙近中移动动物模型。分别在加力后0 天、 1天、2天、3天、5天、7天、每一时间点处死动物，每组8只。进行标本制备和组织切片。一级子标题（小******，宋体，加粗）。
　　2.2 实验方法 原位杂交（In Situ Hybridzation） 。
　　2.2.1 主要试剂及设备
　　兔整合素β1，β3基因mRNA链原位杂交实验试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。
　　试剂盒中含有：胃蛋白酶(x10，Pepsin)、预杂交液、整合素β1，β3寡核甘酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、生物素化抗兔IgG、SABC-POD、生物素化过氧化物酶。
　　原位杂交所用探针采用整合素的三相寡核甘酸探针，经地高辛高效标记。
　　整合素β3寡核甘酸探针序列：
　　(1) 5′-GACAC CTGTG AGAAG TGCCC CACCT GCCCA-3′
　　(2) 5′-GGATG ACTGT GTCGT CAGAT TCCAG TACTA-3′
　　(3) 5′-GCTAA ATTTG AGGAA AGGCG CGCCA GGAGC-3′
　　DEPC（美国Sigma 公司）
　　2.2.2 原位杂交实验方法
　　石蜡切片脱蜡至水，阻断内源性过氧化物酶活性，22分钟。→5％(w／w)DEPC水洗，每次5分钟，2次。→暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃，30分钟。→5mol／L磷酸盐缓冲液PBS (phosphate buffer solution, )洗，每次5分钟，3次,DEPC水洗1次；90％、95％、100％DEPC-酒精脱水干燥。→预杂交：滴加预杂交液于组织上，在42℃湿盒中孵育4小时→杂交：将2块医用纱布用2xSSc浸湿，放入杂交盒底部。→切片空气干燥后，每张切片滴20ul含地高辛标记探针的原位杂交液。→恒温干燥箱40℃杂交过夜。12h后取出湿盒中纱布，并将湿盒开条缝隙，在干燥环境中继续杂交2-3h。
　　2.2.3 杂交信号的检测
　　用2xSSC、 0.5xSSC洗涤，10分钟，2次，→ 0.2xSSC洗涤，10分钟，2次；0．5mol/LPBS洗涤，5分钟，1次。→ 滴加封闭液，室温20分钟， 滴加兔抗地高辛37℃，60分钟→ 0.5mol/LPBS洗2分钟,3次，滴加生物素化抗兔IgG，37℃，30分钟→ 0.5mol/L PBS洗， 滴加SABC复合体，37C，30分钟→ 0.5mol/L洗5分钟，4次DAB显色，苏木素复染→酸酒精处理，流水冲洗，脱水，二甲苯透明，加拿大胶封片。
　　2.2.4 阳性标准
　　胞浆棕黄色染色，着色明显高于背景水平。
　　2.3 图像分析
　　采用尼康E600研究显微镜、SPOT COD CCD摄像头进行图象采集，image-pro plus 4.01图像分析系统软件进行统计分析。每只大鼠选用一张切片，在高倍镜下（×200）进行分析，每张切片在牙周膜区随机选择一个区域，以交互方式测量出破骨细胞整合素β3mRNA表达的平均光密度值(OD optical density)。以三次测量值的均值作为该动物在该时间的实测值。
　　2.4 统计学处理
　　对对照组和阳性染色组的切片的破骨细胞浆着色的平均光密度值进行t检验比较，对正常牙和牙周炎牙齿不同时间段的OD测量值进行单因素方差分析。