大鼠牙周炎牙正畸移动后整合素β3mRNA变化的实验研究(2)
3. 结果与分析
3.1整合素β3 mRNA表达
两组在大多数时段并未观察到破骨细胞整合素β3 mRNA表达阳性。只在加力后12小时和第三天观察到牙周膜内破骨细胞整合素β3 mRNA有弱阳性表达，且正常牙与牙周炎牙两组加力后破骨细胞整合素β3 mRNA阳性信号强度无明显差异。正常牙与牙周病牙加力后牙周膜内破骨细胞整合素β3mRNA平均光密度值比较。
在破骨细胞完全融合形成，开始骨吸收功能后，整合素β3mRNA的合成与整合素蛋白表达均已基本完成。可能是多数时间段成熟破骨细胞未检测到整合素β3mRNA表达的原因。而在加力后12小时和3天，正是破骨细胞大量形成和开始骨粘附的时期，这时可能破骨细胞仍在进行整合素β3的合成，以完成破骨细胞迁移和破骨细胞与骨基质的粘附，开始骨吸收。在整合素β3与骨质粘附完成，骨吸收开始后，可能就不再需要整合素β3 mRNA的合成。
在牙移动后2天3天的标本牙槽骨的骨髓腔内见到大量单核或双核细胞胞浆有强烈阳性信号表达。据研究在各种促破骨细胞形成因素刺激下，破骨细胞前体单核细胞在融合形成破骨细胞时整合素β3的转录与表达水平升高[4]。在相应的切片TRAP( tartrate-resistant acid phosphatase抗酒石酸盐酸性磷酸酶)染色发现，相应的位置有一定程度的TRAP阳性染色，抗酒石酸盐酸性磷酸酶为特异性的破骨细胞表达的酶，因此推测骨髓腔内的阳性细胞可能是正在融合形成破骨细胞的破骨细胞前体。
4. 讨论
在破骨细胞膜上鉴定出来的整合素主要有αvβ3, αvβ1, α5β1, α2β1等，其中αvβ3在破骨细胞表达水平最强，是破骨细胞的主要粘附分子[1]。鼠类的破骨细胞通过整合素αvβ3与细胞外基质包括FN,VN,OPN和裂解的 I 型胶原连接。破骨细胞通过整合素αvβ3与VN粘附，是骨吸收功能的关键步骤,对整合素β3亚单位基因敲除的大鼠进行研究后发现，该型大鼠的破骨细胞无法形成正常的刷状缘和肌动蛋白环，阻碍了骨吸收的进行[3]。抗αVβ3单抗可抑制破骨细胞与细胞外基质的粘附[4]。其它细胞因子也通过调节整合素β3的表达而调节破骨细胞功能。 O'Brien[5]发现骨保护素配体（OPGL） 可刺激破骨细胞从鼠颅骨的骨膜释放和粘附于骨表面，同时有整合素β3蛋白表达的增高，而应用骨保护素（OPG）后，可以阻止破骨细胞的整合素β3蛋白表达，从而抑制破骨细胞的骨吸收。
破骨细胞成熟和开始行使功能后仍表达β3 mRNA的研究较少见。Shinar [6]用原位杂交技术在大鼠骨吸收活跃的部位的破骨细胞上发现有整合素αv和β3 mRNA的阳性表达。Faccio [7]认为在破骨细胞的不同状态中，整合素αvβ3也存在不同状态-“静止状态”与“激活状态”。在实验中，发现在静止态的破骨细胞中，激活状态αvβ3分布于细胞膜的活动区（motile areas）。而在活动状态的破骨细胞中，激活状态αvβ3分布于刷状缘，静止状态的αvβ3位于结合带（sealing zone），肝细胞生长因子（HGF）与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）,离体条件下可以调节整合素αvβ3的构相。通过激活活性αvβ3使破骨细胞迁移并与OPN粘连，开始骨吸收。因此破骨细胞可能在早期既已经完成整合素mRNA的转录和蛋白的合成，只是在需要行使功能时进行构相的改变，激活蛋白的功能。这可能是加力后破骨细胞很少表达整合素β3 mRNA的原因。
大量研究发现整合素β3mRNA高表达于成熟前的前破骨细胞上。Medhora[8]用1,25-(OH)2D3刺激破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化，发现加入1,25-(OH)2D3后， 24小时内细胞的整合素αv 的mRNA表达水平增高，随之而来的是破骨细胞整合素αvβ3蛋白的增高，说明破骨细胞的转化成熟过程中，有整合素αvβ3的参与。Mimura [9]报道1,25-(OH)2D3来源于单核/巨噬细胞家族的破骨细胞前体向破骨细胞转化，整合素β3的mRNA水平也在1天内表达增高，与蛋白表达水平相对应。鼠骨髓巨噬细胞（mouse marrow macrophages BMMs ）可以分化为破骨细胞。Li[10]发现在加入雌激素后，增加[1,25-(OH)2D3]诱导的破骨细胞前体细胞向破骨细胞转化，其中整合素β3 mRNA的高表达持续时间增加，认为是增加了β3 mRNA的稳定性，从而导致蛋白水平的相应增加。以上研究都说明，在破骨细胞前体向破骨细胞转化过程中，是整合素β3 mRNA合成与高表达的时期。
Rody [11]等研究认为加力后破骨细胞来源于牙槽骨骨髓，本实验发现在牙槽骨的骨髓腔内，大量的单核或双核细胞阳性表达整合素β3 mRNA，同时TRAP染色阳性。提示此部位可能是破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化的部位，整合素在加力后12小时和第3天，β3 mRNA阳性表达，这与破骨细胞形成的高峰期相对应，提示整合素β3 mRNA阳性表达似乎与破骨细胞的成熟、聚集有关。
参考文献
[1] Duong LT, Lakkakorpi P, Nakamura I, et al. Integrins and signaling in osteoclast function.Matrix Biol 2000;19(2):97-105
[2] 陈铁楼，周以钧，吴织芬. 牙周病龈组织中血栓素B_2的放射免疫测定及免疫组化定位与定量分析. 华西口腔医学杂志, 1994,04:241-243+337
[3] Cheng SL, Lai CF, Fausto A, et al. Regulation of alphaVbeta3 and alphaVbeta5 integrins by dexamethasone in normal human osteoblastic cells. J Cell Biochem 2000;77(2):265-276
[4] Schneider G, Burridge K. Formation of focal adhesions by osteoblasts adhering to different substrata. Exp Cell Res 1994;214(1):264-269
[5] O'Brien EA, Williams JH, Marshall MJ.Osteoprotegerin ligand regulates osteoclast adherence to the bone surface in mouse calvaria. Biochem Biophys Res Commun 2000 ;274(2):281-290
[6] Shinar DM, Schmidt A, Halperin D, et al. Expression of alpha v and beta 3 integrin subunits in rat osteoclasts in situ. J Bone Miner Res 1993;8(4):403-414
[7] Faccio R, Grano M, Colucci S, et al.Localization and possible role of two different alpha v beta 3 integrin conformations in resting and resorbing osteoclasts. J Cell Sci 2002 ;115(Pt 14):2919-2929
[8] Medhora MM, Teitelbaum S, Chappel J,et al.1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 up-regulates expression of the osteoclast integrin alpha v beta 3. J Biol Chem 1993 ;268(2):1456-1461
[9] Mimura H, Cao X, Ross FP, et al.1,25-Dihydroxyvitamin D3 transcriptionally activates the beta 3-integrin subunit gene in avian osteoclast precursors. Endocrinology 1994;134(3):1061-1066
[10] Li CF, Ross FP, Cao X, et al.Estrogen enhances alpha v beta 3 integrin expression by avian osteoclast precursors via stabilization of beta 3 integrin mRNA. Mol Endocrinol 1995 ;9(7):805-13
[11] Rody WJ Jr, King GJ, Gu G. Osteoclast recruitment to sites of compression in orthodontic tooth movement.Am J Orthod Dentofacial Orthop 2001 ;120(5):477-489
3.1整合素β3 mRNA表达
两组在大多数时段并未观察到破骨细胞整合素β3 mRNA表达阳性。只在加力后12小时和第三天观察到牙周膜内破骨细胞整合素β3 mRNA有弱阳性表达，且正常牙与牙周炎牙两组加力后破骨细胞整合素β3 mRNA阳性信号强度无明显差异。正常牙与牙周病牙加力后牙周膜内破骨细胞整合素β3mRNA平均光密度值比较。
在破骨细胞完全融合形成，开始骨吸收功能后，整合素β3mRNA的合成与整合素蛋白表达均已基本完成。可能是多数时间段成熟破骨细胞未检测到整合素β3mRNA表达的原因。而在加力后12小时和3天，正是破骨细胞大量形成和开始骨粘附的时期，这时可能破骨细胞仍在进行整合素β3的合成，以完成破骨细胞迁移和破骨细胞与骨基质的粘附，开始骨吸收。在整合素β3与骨质粘附完成，骨吸收开始后，可能就不再需要整合素β3 mRNA的合成。
在牙移动后2天3天的标本牙槽骨的骨髓腔内见到大量单核或双核细胞胞浆有强烈阳性信号表达。据研究在各种促破骨细胞形成因素刺激下，破骨细胞前体单核细胞在融合形成破骨细胞时整合素β3的转录与表达水平升高[4]。在相应的切片TRAP( tartrate-resistant acid phosphatase抗酒石酸盐酸性磷酸酶)染色发现，相应的位置有一定程度的TRAP阳性染色，抗酒石酸盐酸性磷酸酶为特异性的破骨细胞表达的酶，因此推测骨髓腔内的阳性细胞可能是正在融合形成破骨细胞的破骨细胞前体。
4. 讨论
在破骨细胞膜上鉴定出来的整合素主要有αvβ3, αvβ1, α5β1, α2β1等，其中αvβ3在破骨细胞表达水平最强，是破骨细胞的主要粘附分子[1]。鼠类的破骨细胞通过整合素αvβ3与细胞外基质包括FN,VN,OPN和裂解的 I 型胶原连接。破骨细胞通过整合素αvβ3与VN粘附，是骨吸收功能的关键步骤,对整合素β3亚单位基因敲除的大鼠进行研究后发现，该型大鼠的破骨细胞无法形成正常的刷状缘和肌动蛋白环，阻碍了骨吸收的进行[3]。抗αVβ3单抗可抑制破骨细胞与细胞外基质的粘附[4]。其它细胞因子也通过调节整合素β3的表达而调节破骨细胞功能。 O'Brien[5]发现骨保护素配体（OPGL） 可刺激破骨细胞从鼠颅骨的骨膜释放和粘附于骨表面，同时有整合素β3蛋白表达的增高，而应用骨保护素（OPG）后，可以阻止破骨细胞的整合素β3蛋白表达，从而抑制破骨细胞的骨吸收。
破骨细胞成熟和开始行使功能后仍表达β3 mRNA的研究较少见。Shinar [6]用原位杂交技术在大鼠骨吸收活跃的部位的破骨细胞上发现有整合素αv和β3 mRNA的阳性表达。Faccio [7]认为在破骨细胞的不同状态中，整合素αvβ3也存在不同状态-“静止状态”与“激活状态”。在实验中，发现在静止态的破骨细胞中，激活状态αvβ3分布于细胞膜的活动区（motile areas）。而在活动状态的破骨细胞中，激活状态αvβ3分布于刷状缘，静止状态的αvβ3位于结合带（sealing zone），肝细胞生长因子（HGF）与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）,离体条件下可以调节整合素αvβ3的构相。通过激活活性αvβ3使破骨细胞迁移并与OPN粘连，开始骨吸收。因此破骨细胞可能在早期既已经完成整合素mRNA的转录和蛋白的合成，只是在需要行使功能时进行构相的改变，激活蛋白的功能。这可能是加力后破骨细胞很少表达整合素β3 mRNA的原因。
大量研究发现整合素β3mRNA高表达于成熟前的前破骨细胞上。Medhora[8]用1,25-(OH)2D3刺激破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化，发现加入1,25-(OH)2D3后， 24小时内细胞的整合素αv 的mRNA表达水平增高，随之而来的是破骨细胞整合素αvβ3蛋白的增高，说明破骨细胞的转化成熟过程中，有整合素αvβ3的参与。Mimura [9]报道1,25-(OH)2D3来源于单核/巨噬细胞家族的破骨细胞前体向破骨细胞转化，整合素β3的mRNA水平也在1天内表达增高，与蛋白表达水平相对应。鼠骨髓巨噬细胞（mouse marrow macrophages BMMs ）可以分化为破骨细胞。Li[10]发现在加入雌激素后，增加[1,25-(OH)2D3]诱导的破骨细胞前体细胞向破骨细胞转化，其中整合素β3 mRNA的高表达持续时间增加，认为是增加了β3 mRNA的稳定性，从而导致蛋白水平的相应增加。以上研究都说明，在破骨细胞前体向破骨细胞转化过程中，是整合素β3 mRNA合成与高表达的时期。
Rody [11]等研究认为加力后破骨细胞来源于牙槽骨骨髓，本实验发现在牙槽骨的骨髓腔内，大量的单核或双核细胞阳性表达整合素β3 mRNA，同时TRAP染色阳性。提示此部位可能是破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化的部位，整合素在加力后12小时和第3天，β3 mRNA阳性表达，这与破骨细胞形成的高峰期相对应，提示整合素β3 mRNA阳性表达似乎与破骨细胞的成熟、聚集有关。
参考文献
[1] Duong LT, Lakkakorpi P, Nakamura I, et al. Integrins and signaling in osteoclast function.Matrix Biol 2000;19(2):97-105
[2] 陈铁楼，周以钧，吴织芬. 牙周病龈组织中血栓素B_2的放射免疫测定及免疫组化定位与定量分析. 华西口腔医学杂志, 1994,04:241-243+337
[3] Cheng SL, Lai CF, Fausto A, et al. Regulation of alphaVbeta3 and alphaVbeta5 integrins by dexamethasone in normal human osteoblastic cells. J Cell Biochem 2000;77(2):265-276
[4] Schneider G, Burridge K. Formation of focal adhesions by osteoblasts adhering to different substrata. Exp Cell Res 1994;214(1):264-269
[5] O'Brien EA, Williams JH, Marshall MJ.Osteoprotegerin ligand regulates osteoclast adherence to the bone surface in mouse calvaria. Biochem Biophys Res Commun 2000 ;274(2):281-290
[6] Shinar DM, Schmidt A, Halperin D, et al. Expression of alpha v and beta 3 integrin subunits in rat osteoclasts in situ. J Bone Miner Res 1993;8(4):403-414
[7] Faccio R, Grano M, Colucci S, et al.Localization and possible role of two different alpha v beta 3 integrin conformations in resting and resorbing osteoclasts. J Cell Sci 2002 ;115(Pt 14):2919-2929
[8] Medhora MM, Teitelbaum S, Chappel J,et al.1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 up-regulates expression of the osteoclast integrin alpha v beta 3. J Biol Chem 1993 ;268(2):1456-1461
[9] Mimura H, Cao X, Ross FP, et al.1,25-Dihydroxyvitamin D3 transcriptionally activates the beta 3-integrin subunit gene in avian osteoclast precursors. Endocrinology 1994;134(3):1061-1066
[10] Li CF, Ross FP, Cao X, et al.Estrogen enhances alpha v beta 3 integrin expression by avian osteoclast precursors via stabilization of beta 3 integrin mRNA. Mol Endocrinol 1995 ;9(7):805-13
[11] Rody WJ Jr, King GJ, Gu G. Osteoclast recruitment to sites of compression in orthodontic tooth movement.Am J Orthod Dentofacial Orthop 2001 ;120(5):477-489
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