作者：陈晓涛，钟良军，杨柯，钱雅静，李泽慧 作者单位：新疆维吾尔自治区人民医院口腔科， 新疆乌鲁木齐830001

　　【摘要】 目的: 筛选方便、快捷、有效地获取细菌基因组DNA的方法。方法: 采用UNIQ10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒法和Chelex100法获取患者龈下菌斑DNA，比较作为PCR扩增模板检测牙龈卟啉单胞菌感染位点的检出率差异，并对2种方法进行比较。结果: 试剂盒法与Chelex100法对牙龈卟啉单胞菌的感染位点检出率差异无统计学意义，但Chelex100法提取DNA更简单、快速。结论：Chelex100法抽提细菌基因组DNA适用于对大样本牙周炎患者作细菌学检测分析。

　　【关键词】 DNA; 牙龈卟啉单胞菌; 试剂盒法; Chelex100法

　　The comparison of two ways for extraction of DNA from dental plaque

　　CHEN Xiaotao, ZHONG Liangjun, YANG Ke, et al

　　(Department of Stomatology, The People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830001, China)

　　Abstract: Objective: The study was performed to try an alternative method as DNA source for PCR detection. Methods: DNA of subgingival plaque was extracted by two differedt kinds of methods,which were UNIQ10 Bateria Kit and Chelex100 assay . The obtained DNA were used as template to detect Porphyromonas gingivalis. Result: There was no statistically significance between two methods. Conclusion: Chelex100 assay was simple and conventional in extraction of bacteria DNA.

　　Key words: DNA; porphyromonas gingivalis; kit assay ; Chelex100

　　牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, 简称P.g)是公认的慢性牙周炎优势致病菌之一，与牙周炎的发生、治疗后复发或病情加重密切相关。由于该菌属难培养的厌氧菌，分离鉴定程序繁琐，不利于进一步的研究。应用聚合酶链式反应(PCR反应)检测P.g具有敏感、特异和快速等优点。提取足够量的DNA并使DNA的链完整，蛋白含量尽可能低是PCR反应成功的关键。目前,细菌DNA提取方法众多,但由于提取机理和步骤的差别,获得DNA的量及纯度各不相同。本实验采用UNIQ10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒法和Chelex100法获取慢性牙周炎患者的细菌基因组DNA，通过PCR技术扩增目的片断，比较牙龈卟啉单胞菌在患病相同感染位点的检出率,旨在筛选一种操作简单、快捷、价廉的方法,以有效获取细菌基因组DNA。

　　1材料和方法

　　1.1样本收集

　　选取2005年4月～2005年12月在新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院和和田县人民医院口腔科就诊的52例慢性牙周炎患者,在2颗患牙的牙周袋最深部位作为采样的位点。无菌棉球隔湿、干燥后，用无菌刮治器沿根面收集位于患牙牙周袋底的龈下菌斑，置入盛有0.5 ml厌氧转运液的EP管中封存，于-20℃低温保存。

　　1.2试剂和设备

　　1.2.1试剂UNIQ10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒 (上海);Chelex100(美国); 琼脂糖(英国);无菌去离子纯水(自制);蛋白酶K;10×PCR缓冲液;dNTP、TaqDNA聚合酶;Puc19/Marker;细菌特异性引物(均由上海生工生物工程公司提供)。

　　1.2.2主要设备恒温水浴箱(SHH.W21型，上海);高速台式离心机(TGL13，上海);PCR扩增仪(美国 BIORAD公司);电泳仪(DYYⅢ2，北京六一);水平电泳槽(北京六一);凝胶成像仪(BioSensSC720 ，上海山富科学仪器有限公司)。

　　1.3方法

　　1.3.1DNA模板制备(1)试剂盒法抽提DNA: 取菌斑样本,室温解冻, 根据说明书进行分离。首先震荡混匀10～15 s，离心(4℃，15 000 r/min, 5 min)收集细菌沉淀。加入200 μl含溶菌酶的TE(400 μg/ml)，酶解4 min。加入400 μl Digestion Buffer 混合所有菌细胞悬液，继续加入 proteinase K 3 μl，在55℃保温5 min。加入无水乙醇260 μl，混匀后转移到套放于2 ml的收集管内的UNIQ10柱中，室温下离心(8 000 r/min, 1 min)，弃废液。加入500 μl Wash Solution轻轻混匀，离心(4℃，10 000 r/min, 30 s)，反复2次。离心空柱后更换新的EP管，最后加Elution Buffer 40 μl,室温下离心，室温放置2 min，离心管中的液体即为基因组DNA。 (2)Chelex100法抽提DNA: 取菌斑室温下解冻，震荡混匀10~15 s，离心(4℃，15 000 r/min, 5 min)收集沉淀。加入5% Chelex100液20 μl，在100℃水浴10 min，，立即冰浴1 min，室温下离心(12 000 r/min，10 min)，取上清液备用。-20℃保存。

　　1.3.2目的基因扩增PCR反应条件: 总反应体积20 μl,引物各0.8 μl (10 μmol/L), DNTP 0.4 μl(10 μmol/L), 10×PCR缓冲液2 μl, MgCl2 1.2 μl (25 mmol/L ), TaqDNA聚合酶0.5 U, 模板DNA 2 μl ,用无菌去离子水补足总体积至20 μl 。循环参数：95℃预变性反应2 min, 95℃变性30 s,60℃复性1 min,72℃延伸1 min, 36个循环，最后72℃延伸2 min, 4℃保存。4 μl PCR产物点样，经1.5%琼脂糖凝胶电泳 (100 V, 45 min)，凝胶成像仪读取结果，证实获得的扩增产物为404 bp的目的基因片段。以P.g标准菌株ATCC33277作为阳性对照(四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供)，等体积三蒸水作为空白对照。

　　1.3.3PCR质量控制措施所有实验标本的测定均在盲法下进行，并随机抽取10%的样本做重复性实验，检测PCR结果的可靠性。

　　1.4统计学处理应用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，采用Fisher′s精确概率法进行χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.12种方法的操作比较试剂盒法提取龈下菌斑DNA共需耗时50 min, 分九步完成，所需检测成本为8元/份。Chelex100法抽提DNA的操作仅需要三步，15 min完成全部过程, 成本为0.5 元/份。

　　2.22种方法对牙龈卟啉单胞菌感染位点的阳性检出率比较采用P.g的16SrRNA PCR鉴定有78个位点感染牙龈卟啉单胞菌，其中试剂盒法检出49个(62.8%)，Chelex100法检出46个(58.7%)，经检验，2种方法检出率差异无统计学意义(χ2=0.242, P>0.05 )。

　　2.3PCR结果典型电泳结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳 (100 V, 45 min,)，凝胶成像仪读取结果，证实试剂盒法和Chelex100法提取到细菌基因组DNA，均获得的扩增产物为404 bp的目的基因片段,见图1。