摘　要：目的：建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型。并对其生物学特性进行研究。方法：选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验，在不同培养体系中进行体外培养，通过倒置显微镜观察、透射电镜、扫描电镜、组织化学染色技术、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性进行研究。结果：获得的细胞呈多种形态，有长短不一、大小不均的胞浆突起，且互相连接，细胞互相重叠呈复层生长，并形成细胞结节；胞浆丰富，富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等，具有合成分泌功能旺盛的结构，与典型成骨细胞的形态结构相似。同时，胞浆富含碱性磷酸酶活性，在条件培养基中细胞发生钙化现象，这与典型成骨细胞的生物学特性相似。且获得的细胞在体外能连续传代，形态和功能不变。结论：我们认为用骨髓基质细胞为材料进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型的生物学模型，为人工骨替代材料的研制、成骨细胞移植修复骨缺损等开辟了新的途径。 　　Peck在1964年首次将胎鼠骨组织进行体外成骨细胞培养，开创了成骨细胞体外培养技术用于研究骨代谢的新纪元。多年来，成骨细胞体外培养的生物学模型大多数是采用动物或人的骨质或骨膜，不仅取材困难，来源有限，而且对机体损伤大，不利于自体回植研究，临床价值有限。近年来，随着对成骨细胞来源及骨髓成骨潜能研究的深入，已证实成骨细胞来源于骨髓基质细胞，并可在体外培养转化为成骨细胞，在条件培养液中可以人为促进成骨［1］。本研究选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验，目的在于建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型，并对其生物学特性进行研究，为进一步对成骨细胞的研究和应用开辟新的途径。 1　材料与方法1.1　材料及主要试剂　　体重为1.5～2.0kg的大耳白兔，雌雄不拘。常规RPMI 1640培养液(GIBCO)：内含20%新生小牛血清(杭州四季生物工程材料研究所)，50μg/ml维生素C,0.5mg/ml HEPES，100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素。条件RPMI 1640培养液：常规RPMI 1640培养液加入β-甘油磷酸钠(10mmol/L)、地塞米松(10-8mol/L)。D-Hank液、0.25%胰蛋白酶、骨髓穿刺手术用品、培养器皿及培养用液均无菌处理后备用。1.2　取材　　称取动物，2.5%硫喷妥钠注射液腹腔注射麻醉(30mg/kg)。无菌条件下分别自左右两侧股骨粗隆处用18号骨髓穿刺针共抽取骨髓悬液4～6ml，加入等体积的抗凝RPMI 1640培养液混均后，加至内含等体积，比重为1.077淋巴细胞分离液的离心管中，以2 000r/min×20min离心，收集界面的有核细胞层，再用D-Hank液洗涤两次，加入常规RPMI 1640培养液稀释，制成细胞悬液。1.3　骨髓基质细胞原代培养　　将上述细胞悬液调整至1×106/ml的细胞密度取3ml分别接种于25ml培养瓶(有或无盖玻片)中，加入足量常规RPMI 1640培养液，密闭后置入37°C恒温培养箱中静置培养，一周后半量换液，以后隔3～4天换液并逐日观察。1.4　骨髓基质细胞传代培养　　经过12～14天培养，细胞增殖融合成层后，用0.25%胰蛋白酶消化按1∶1一分为二传代，并在每个培养瓶内预先放入两块长形盖玻片，其中一瓶与原代细胞培养条件相同作连续传代培养，周而复始。另留数瓶不作传代，加入条件RPMI 1640培养液长期培养，隔3～4天换液，拟观察钙盐沉着情况。1.5　观察与鉴定1.5.1　活体细胞显微镜观察：用倒置显微镜逐日观察培养细胞的生长情况和形态特征。1.5.2　HE染色：传代的培养细胞(第2代)接种培养4天后，把爬满细胞的盖玻片取出，用37°C生理盐水漂洗数次，经10%中性缓冲福尔马林液固定30min，进行常规HE染色。1.5.3　碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色：将原代生长成层及传代的培养细胞(第2代)接种培养4天，把爬满细胞的玻片取出，95%酒精固定10min，采用改良Gomonri钙-钴法测定细胞的ALP活性。阳性细胞计数方法为各代细胞随机计数三张染色，每张随机计数500个细胞，算出ALP阳性细胞均数及阳性率。本新闻共4页,当前在第1页  1  2  3  4