【摘要】　目的　探讨程序化细胞死亡（programmed cell death，PCD）及bcl-2、Bax基因在颞下颌关节发育中的作用。方法　利用缺口末端转移酶标记法（tdt-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL法）、原位杂交检测mRNA技术及免疫组织化学染色分别对SD胎鼠及生后1周颞下颌关节发育不同时期PCD、bcl-2 mRNA及bcl-2、Bax蛋白的表达进行了观察。结果　各时期髁突软骨细胞中均有PCD出现，阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖层及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域；髁突软骨增殖层及浅肥厚层大部分细胞bcl-2 mRNA表达阳性，深层肥厚层仅有极少数成熟软骨细胞bcl-2 mRNA表达阳性；bcl-2蛋白表达的分布与bcl-2 mRNA基因的表达部位基本一致，进入深层肥厚层减弱、消失；Bax则在髁突软骨全层均有明显表达。结论　髁突软骨细胞PCD主要是受内在bcl-2及Bax基因控制，PCD的部位及数量取决于bcl-2及Bax表达量的变化。bcl-2可能是维持软骨细胞生命，保证软骨细胞增殖、分化和成熟的重要基因之一。 　　颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）发育的研究表明，髁突软骨是下颌骨的主要生长区，在TMJ发育的早期，髁突主要由软骨细胞组成，此期的髁突软骨层具有类似于长骨生长板独立生长的特性，其生长主要受内在基因的控制［1］。我们通过观察TMJ发育中髁突软骨的PCD及其与bcl-2、Bax基因表达的关系，探讨了PCD及bcl-2、Bax基因在TMJ发育中的内在调控作用。 　　材料和方法 　　1.动物模型及标本制备：选用纯系、3个月龄SD大鼠（上海BK公司提供）20只，雌雄4∶1同笼，每日8∶00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0 d，分别于妊娠13、14、15、16、17、18、19、20 d脱颈处死大鼠，切取胎鼠TMJ置于4%多聚甲醛中固定，另取出生后1、2、3、4、5、6、7 d幼鼠各3只，均取其TMJ部置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的4%多聚甲醛液中 固定、脱钙，流水冲洗后，常规脱水，石蜡包埋。作TMJ连续矢状切片，厚度约5 μm，切片前载玻片预先严格清洁处理并涂APES胶。 　　2． TUNEL法标记PCD细胞：切片常规脱蜡放置水中，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15 min；3%H2O2 PBS溶液中处理5 min后，加50 μl的平衡液（TUNEL试剂盒原配，美国Oncor公司）1 min；再加含TDT酶反应液15 μl，37 ℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应；buffer1漂洗2次（15 min/次）后加2%的正常羊血清孵育30 min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h；buffer 1 、buffer 3漂洗后，加新配制的显色液 (NBT/BCIP显色系统，用buffer3配制，NBT4.5 μl、BCIP3.5 μl、左旋咪唑0.24 g/L) 20 μl，暗处显色；中止显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。 　　3．原位杂交检测bcl-2基因的表达： 　　（1） 探针及标记：质粒pDOR-SB8.4（第四军医大学生化教研室朱峰博士惠赠）含1.9 kb的bcl-2基因片段。取已鉴定的质粒DNA，经EcoRI酶切后，将目的基因用冻溶法回收。bcl-2探针参照地高辛标记检测试剂盒（boehringer mannheim公司）说明书，采用随机引物法标记。 　　（2）bcl-2 mRNA原位杂交：①石蜡切片脱蜡后置于DEPC水中，分别用0.2 mol/L盐酸和20 mg/L的蛋白酶K处理，梯度酒精脱水后室温干燥；②用地高辛标记探针于42 ℃杂交后，分别用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、buffer1、buffer2依次充分洗涤；③2%正常羊血清封闭30 min，以下步骤与TUNEL染色相同。 　　4．免疫组织化学检测bcl-2及Bax的蛋白表达：石蜡切片脱蜡至水，经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10 min后，羊血清封闭30 min；加bcl-2及Bax蛋白的单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）置于4℃24 h，室温下复温1 h后滴加生物素化羊抗鼠二抗 37 ℃反应30 min；再加ABC复合物37 ℃孵育30 min，DAB显色后，二甲苯透明、封片。本新闻共3页,当前在第1页  1  2  3