〔摘要〕　目的：探讨热休克蛋白70(HSP70)在细胞创伤后增殖中的作用。方法：采用细胞机械创伤模型，检测创伤后48 h时热处理细胞及 非热处理细胞的增殖活性，并用免疫细胞化学的方法检测两组细胞生长过程中HSP70的表达 。结果：非热处理组细胞在增殖期表达HSP70。热处理可诱导HSP70 的表达，热处理组创伤后细胞的增殖活性明显高于非热处理组。结论：HSP70参与细胞增殖过程，热处理引起的细胞增殖活性升高可能与HSP70的功能有关。

　　热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是细胞内一类进化上高度保守的应激蛋白，可 参与蛋白的折叠、组装、转运与蛋白复合物的降解以及DNA的复制与修复等过程〔1〕 ，而在细胞增殖时这些作用至关重要。在HSPs家族中，HSP70是最重要的一类，哺乳动物细 胞中的HSPs即以HSP70为主。本实验应用NIH3T3细胞的体外创伤模型，试图探讨HSP70在细胞 创伤后增殖中的作用，进而研究其与创伤愈合的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要材料

　　NIH3T3细胞及培养用品、台盼兰染液、MTT溶液(5 g/L)，由第四军医大学口腔医学院生物教 研室提供。酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。HSP70单克隆抗体(Sigma公司)。SABC试剂盒( 博士德公司)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞培养　用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液常规培养NIH3T3细胞。实验 分为热处理组及非热处理组。

　　1.2.2　热处理　待细胞长成单层细胞后，将热处理组细胞置于42 ℃环境下孵育20 min，用 培养液冲洗两次后，再加入培养液于37 ℃环境下继续培养。非热处理组细胞作对照。

　　1.2.3　细胞创伤模型的建立　3T3细胞按1×104/孔密度接种于96孔培养板，37 ℃培养。 待长成单层细胞后按Stewart〔2〕方式用200 μl移液器滴头造成细胞机械性划伤模 型，用吸管吸去脱落细胞，并用新鲜培养液冲洗两次后再加入培养液继续培养。

　　1.2.4　细胞活性检测　热处理组单层细胞经热处理后消化成单细胞悬液，进行台盼兰排斥 试验〔3〕，计算细胞存活率，并与非热处理组比较。

　　1.2.5　细胞增殖活性检测　3T3细胞按1×104/孔的细胞密度接种于96孔培养板，待长成 单层细胞后，按上述方法进行热处理及创伤，创伤后继续培养48 h行MTT比色试验〔3〕 。

　　1.2.6　免疫细胞化学检测染色　3T3细胞按2×104/孔接种于24孔板，孔内置0.3 cm×0.3 cm大小盖玻片。24 h后热处理组按上述方法进行热处理，并于热处理后0、24、48 h及细胞 长成单层时取出细胞爬片，用体积分数为95%酒精固定后按SABC方法(按试剂盒说明)检测HSP 70的表达。同时，非热处理组作对照。

　　1.3　统计学处理

　　对创伤后48 h时两组细胞MTT比色值及热处理后两组细胞的存活率进行t检验。

　　2　结　果

　　2.1　一般观察

　　3T3细胞为梭形或多突起形扁平细胞，接种24 h后细胞贴壁、伸展，48 h时细胞增殖旺盛， 可见细胞分裂现象。按1×104/孔接种于96孔板，72 h后即可长成单层细胞，创伤后12 h 可观察到创缘细胞向创伤裸区内移动。创伤后48 h，热处理组创伤裸区内细胞数目较非热处 理组多，已基本覆盖创伤区(如图1，2)。

1　热处理组(3T3细胞)创伤后48 h细胞基本已覆盖创伤裸区(10×△ 示创缘)

图2　非处理组(3T3细胞)创伤后48 h细胞数目较热处理组少(△示创缘)

　　2.2　细胞存活率

　　热处理组(95.5±0.5)%，非热处理组(93.5±1.5)%，两组间无显著性差异P＞0.05。

　　2.3　细胞增殖活性检测

　　MTT比色试验结果表明热处理组光吸收值为2.15±0.14，非热处理组1.67±0.28，两组 相比较具有显著性差异P＜0.01。

　　2.4　免疫细胞化学染色结果

　　非热处理组细胞接种24 h后(相当于热处理后 0 h)，细胞贴壁、伸展，此时HSP70表达基本 为阴性；48 h时，在胞浆及胞核内均可见HSP70着色，当细胞长成单层后，HSP70表达又转为 阴性。在热处理组，热处理后即可见细胞浆内HSP70表达，此后，其表达一直持续在较高水 平。即使细胞长成单层时，HSP70的表达仍为阳性。