〔摘要〕 　目的：探讨骨折愈合过程中P21ras对细胞增殖分化的调控作用。方法：建立颌骨骨折模型，利用免疫组化法观察颌骨骨折愈合的不同阶段P21ras的表达。结果：骨折愈合早期（第1～5 d）仅见少量P21ras阳性细胞；而骨痂形成期（第7～14 d）骨断端附近的阳性细胞数量和染色强度明显增加；骨改建期（第21～28 d）阳性细胞数量和强度均减少，与正常骨基本相同。结论：P21ras参与了骨折愈合过程中细胞的增殖和分化。

　　骨折后细胞接受刺激信号，产生各种各样的生物学效应，包括细胞增殖、分化及细胞外基质的合成等一系列变化过程，受到多种因素的精细调控。信息传递G蛋白类癌基因ras家族（包括H-ras, K-ras和N-ras）的表达产物P21参与膜的信号转导，在细胞信息传递过程中起着重要的作用，是参与细胞增殖的重要基因〔1〕。以往对P21ras的研究多集中在它与肿瘤的关系方面，而其在创伤愈合中的作用研究较少。本实验建立了颌骨骨折模型，用免疫组化方法观察P21ras在骨折愈合不同时期的表达，探讨其在组织修复中的作用及意义。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要材料

　　健康成年雄性家兔（24只，1.6～2.2 kg）由第四军医大学动物中心提供；鼠抗人P21（H-ras）单克隆抗体(McAb）购自美国Oncogene Science公司；免疫组化ABC试剂盒为Dako公司产品。

　　1.2　骨折模型的建立及标本处理〔2〕

　　在30 g/L戊巴比妥（每kg体重给1 ml）全麻下，于家兔单侧下颌骨角前切迹处用牙科涡轮机造成完全性骨折，钢丝结扎固定，逐层缝合骨膜、肌肉和皮肤。分别于术后第1、3、5、7、11、14、21和28 d取材（每个时间点3只动物）。取材前用40 g/L多聚甲醛灌注固定，然后取骨断端及周围组织，后固定4 h（4 ℃）。常规脱钙，石蜡包埋，5 μm厚连续切片2张，分别行HE染色和P21免疫组化检测。

　　1.3　免疫组化染色方法

　　(1)切片脱蜡至水；(2)体积分数为3% H2O2中孵育10 min；(3)切片浸入0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）中，经微波处理10 min；(4)正常羊血清37 ℃孵育20 min；(5)滴加鼠抗人P21 (H-ras) McAb，4 ℃过夜；(6)滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37 ℃温育30 min；(7)滴加ABC复合物，37 ℃温育30 min。上述各步之间均经PBS缓冲液充分振洗；(8)显色液（终浓度为0.5 g/L DAB，体积分数为0.03% H2O2）用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）、DAB和新鲜的H2O2配制；(9)显色后用苏木精稍衬染，脱水，透明，封片。上述各步未加说明者，皆为室温条件下。染色同时用PBS代替 P21ras McAb作为阴性对照，已多次重复实验均证明为阳性的1例软骨肉瘤为阳性对照。

　　2　结　果

　　2.1　骨折愈合过程的HE染色观察

　　骨折后第1 d，骨断端间隙由血肿充填；第3 d血肿开始机化，成纤维细胞、毛细血管芽长入血凝块，形成肉芽组织；第5 d，骨折损伤刺激骨内膜和骨外膜生发层的细胞分化增生并在骨断端附近聚集；第7 d，新生骨小梁明显增多，其外周可见成骨细胞；第11 d，软骨岛数量增多，并可见肥大的软骨细胞。膜内成骨活跃，新生骨小梁基本覆盖骨断端；第14 d，骨小梁变粗大，形成骨髓腔，可见较成熟的骨组织；第21、28 d，骨折处新骨连接成片，趋向于连接骨断端及封闭外界与骨髓腔的交通。

　　2.2　骨折愈合过程中P21ras的表达

　　阳性对照中，肿瘤性软骨细胞胞浆内可见棕黄染色。所有阴性对照均为阴性反应。骨折后第1、3 d，骨折部位血痂区的部分单核细胞呈弱阳性反应；第5 d，骨断端附近的阳性细胞较前增多；第7 d，新骨形成区内的成骨细胞呈强阳性，新骨附近的一些成纤维细胞也为阳性着色（图1），而离骨断端较远的部位中只有个别成骨细胞为阳性；第11、14 d骨痂内的成骨细胞仍呈阳性反应，远离骨断端部位的个别成骨细胞仍为阳性，而纤维组织区和正常骨呈阴性反应；第21、28 d，阳性着色强度下降，个别成骨细胞为弱阳性，大部分成骨细胞为阴性，骨细胞和骨膜均为阴性反应，与正常骨的染色情况趋于一致。