〔摘要〕　目的：观察运用新西兰家兔进行组织工程骨和软骨研究的可行性。方法：分离髂骨中的骨髓基质细胞，培养扩增8 d，用地塞米松诱导分化为成骨细胞，细胞计数，并检查碱性磷酸酶活性。软骨细胞取自新西兰兔双侧耳软骨，用II型胶原酶消化，细胞计数。将成骨细胞和软骨细胞按组织工程方法建造骨组织和软骨组织。结果：10只动物中平均每只动物可获取9×106成骨细胞和60×106软骨细胞。成骨细胞碱性磷酸酶表达阳性。应用经诱导的成骨细胞和分离的软骨细胞，在动物体内成功地建造了骨组织和软骨组织。结论：新西兰兔可以作为组织工程骨和软骨研究的动物模型。

　　动物模型的价值体现在对人体生理和病理状况模拟的相似性和对临床医学指导和应用方法可重复的真实性〔1，2〕。组织工程作为近十年来新兴及快速发展研究领域，组织工程的动物模型同样经历着不断发展、不断完善的过程〔3，4〕。我们在组织工程骨和软骨

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　骨髓基质细胞培养液　DMEM (Gibco)，内含β-甘油磷酸钠（Sigma）、L-抗坏血酸 （Sigma）和体积分数为10%胎牛血清。

　　 1.1.2　地塞米松（Sigma），II型胶原酶（Sigma）。

　　 1.1.3　支架及载体材料　松质骨基质〔5〕（本实验室制备），藻酸盐(Protan, Portsmouth, NH)。成年新西兰兔10只(第四军医大学实验动物研究中心提供)。

　　 1.2　方法

　　1.2.1骨髓基质细胞的分离与培养　无菌条件下显露新西兰兔双侧髂骨，用牙科电钻切取髂骨。 去净髂骨周围的软组织及髂骨上缘的软骨组织。在含有抗生素的无血清DMEM培养液 中，将髂骨用剪刀剪成碎块，然后用吸管反复吹打，使髂骨中的骨髓基质细胞充分溢出， 筛网过滤，收集骨髓基质细胞。将骨髓基质细胞转移至8个细胞培养皿(20 mm×100 mm)中, 加入骨髓基质细胞培养液，置CO2孵育箱中，每2 d换液1次。

　　 1.2.2　骨髓基质细胞的诱导　骨髓基质细胞培养至第8 d时加入10 nmol/L的地塞米松，诱导3 d, 使骨髓基质细胞转化为成骨细胞。然后用2.5 g/L胰蛋白酶消化25 min , 收集所有培养皿的细胞，用无血清DMEM漂洗3遍，进行细胞计数。

　　 1.2.3　软骨取材及软骨细胞的分离培养　无菌条件下取双侧新西兰兔耳，剥离兔耳表面皮肤，去净耳软骨周围软组织，经含抗生素生理盐水反复清洗后，剪成碎块。用2 g/L Ⅱ型胶原酶消化18 h后，离心、去上清液，然后用无血清DMEM漂洗3遍，细胞计数。

　　 1.2.4　碱性磷酸酶活性检测　取5×104/ml骨髓基质细胞接种于 96 孔细胞培养板中，实验组加含地塞米松的培养液，对照组仅加入DMEM培养液。72 h后离心去上清液，加入体积分数为0.01% Triton Ⅹ-100，然后加入碱性磷酸酶反应液，用酶联免疫检测仪（410 nm）测碱性磷酸酶活性，统计学分析。

　　 1.2.5　自体成骨细胞/支架和自体软骨细胞/载体复合物的形成　取4×106/ml由地塞米松诱导的成骨细胞与10 g/L的藻酸盐混合，注射和接种于异体松质骨基质的多孔网状支架中。取4×107/ml软骨细胞与12 g/L的藻酸盐混合。将自体成骨细胞/支架和自体软骨细胞/载体复合物植入或注射于新西兰兔皮下。移植后8周取材，进行组织学检查。

　　2　结　果

　　2.1　细胞的获取量　骨髓基质细胞体外培养9～12 d可以长满整个培养皿，故选择第8 d加入地塞米松诱导，3 d后可使骨髓基质细胞分化为成骨细胞。细胞计数显示，按本实验方法每只成年新西兰兔平均获取的细胞量为9×106/ml。本实验取双侧兔耳，消化分离软骨细胞，平均每只成年新西兰兔可获取软骨细胞60×106/ml。由于未做软骨细胞的体外培养，扩增，故软骨细胞的最大获取量未知。