〔摘要〕目的：建立稳定表达BMPs II型突变受体的NIH3T3细胞株。方法：用FuGENE6 Transfection Reagent Kit真核转染试剂盒将携带BMPs II型突变受体的cDNA的真核表达载体转染NIH3T3细胞。结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆转染细胞，neo基因原位杂交阳性。结论：成功建立了稳定表达BMPs II型突变受体的NIH3T3细胞株。

　　骨形成蛋白（BMPs)不仅在骨，软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用 ，而且在胚胎发育、器官形成及细胞分化中起着十分重要的调控作用〔1，2〕。与其它TGF-β超家族成员一样，BMPs在细胞表面与BMP的I、II型受体相互作用,I型受体可以和过量的配体结合，而II型受体与配体的结合则是特异性的〔2〕。为研究BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用，我们以BMPs II型突变受体的基因为目的基因，以小鼠成纤维细胞为载体细胞，建立了稳定表达BMPs II型突变受体的细胞，从而为进一步从信号转导水平探讨BMP对细胞分化及组织器官发育的调控奠定了基础。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　pC-4质粒为含有BMPs II型突变受体cDNA（cDNA由日本Kawasaki医学院分子生物所的Nohno教授提供）的真核表达载体（由本实验室构建）；FuGENE6 transfection reagent kit 为Boehringer Mannheim公司产品；G-418为Gibco公司产品； NIH3T3细胞由西京医院刘松波博士提供；neo基因探针由本实验室岳文博士提供。

　　1.2　NIH3T3细胞的培养

　　NIH3T3细胞，用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液，在37 ℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度下培养，3 d换液1次，传代3到4次使细胞达到良好的生长状态。

　　1.3　BMPs II型突变受体基因的转染

　　①转染前一天传代到6孔培养板(3×105,2 ml培养液)，在转染时细胞密度达到50％～ 80％（面积百分比）；②取消毒的EP管1支，加入无血清培养液100 μl，再加入Fugene6 Transfection 试剂5 μl；③室温孵育5 min；④加入克隆有转染基因的质粒DNA 1.5 μg到另1支EP管中，体积为5 μl；⑤将②EP管中孵育好的试剂加入到④EP管中，轻弹使其混匀，室温孵育15 min；⑥将①培养板的培养液吸弃，然后将⑤中孵育好的试剂滴加入到培养孔内，轻轻转动使其均匀分布；⑦在CO2孵箱中继续培养48 h；⑧将细胞传代至培养瓶中，加入G-418 300 mg/L 进行筛选，3 d换液1次；设未转染细胞对照；⑨2周后转染细胞出现克隆性生长，用胰酶消化法转移细胞克隆，扩大培养，用Cytospin甩片机制备细胞甩片，固定于40 g/L多聚甲醛(含体积分数的1‰ DEPC)16 h，-20 ℃保存备用。

　　1.4　转染后鉴定

　　1.4.1　neo基因探针的制备　用Hind Ⅲ和ClaⅠ双酶切质粒pDOR(neo)，回收1.9 kb的片段，得到neo基因，用随机引物法标记探针。

　　1.4.2　原位杂交　转染细胞甩片经体积分数0.3% Triton-100、0.2mol/L HCL及蛋白酶K处理，40 g/L多聚甲醛(含体积分数为1‰ DEPC)后固定，逐级酒精脱水干燥，滴加热变性的含neo基因探针的杂交液，42 ℃过夜；2×SSC、1×SSC、0.5×SSC漂洗，正常羊血清封闭，滴加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体37 ℃，2 h；BufferⅠ、BufferⅢ漂洗，NBT/BCIP暗处显色。

　　1.4.3　设未转染细胞对照。

　　2　结　果

　　2.1　细胞克隆

　　转染细胞经G-418筛选，2周后得到抗G-418的阳性细胞克隆，而未转染细胞在含G-418的培养液中逐渐全部死亡，初步证明BMPs II型突变受体基因的转染成功（见图1）。

图1　转染细胞阳性克隆（倒置显微镜×100）

　　2.2　neo基因原位杂交

　　在转染细胞的胞浆中有蓝色颗粒样阳性杂交信号（图2）,进一步证明BMPs II型突变受体基因的转染NIH3T3细胞成功，并有BMPs II型突变受体mRNA的表达；未转染细胞未见阳性信号（图3)。

图2　转染细胞（原位杂交×200）