摘　要：目的　为了评价DNA含量和AgNOR定量在研究腮腺混合瘤细胞增殖活性的价值。方法　对60例良性无复发、复发和恶性腮腺混合瘤用流式细胞仪和银染色核形成技术作DNA含量和AgNOR定量测定。结果　异倍体率，高S期细胞比率(SPF)率，AgNOR大小和分布在无复发与复发组间无显著差异，而良性与恶性肿瘤间有显著差异；AgNOR数目和形态各组间有显著差异；高SPF率与AgNOR均能反映其细胞增殖活性。结论　高SPF率和AgNOR对良恶性混合瘤的鉴别有重要价值；AgNOR颗粒数目和形态对良性混合瘤的复发有较高估测价值。

　　国内外已有用流式细胞测量术(flow cytometry, FCM)或银染色核形成区(silver staining nucleolar organiger region, AgNOR)技术，对涎腺混合瘤作DNA含量或AgNOR定量分析，研究其细胞增殖活性［1～3］。但未见两种技术的比较研究报告。作者用FCM国际统一新标准［4］和Ploton等［5］改良一步法对良性和恶性混合瘤分别作DNA含量测量和AgNOR计数，旨在比较两技术在研究其细胞增殖活性的临床价值。

1　材料与方法

1.1　材料
　　选用经病理诊断为腮腺混合瘤石蜡包埋标本60例。经5～14年随访，良性腮腺混合瘤无复发33例和复发11例(原发瘤标本)，恶性16例。良性者行肿瘤包膜外切除，恶性者作腮腺全切除。
1.2　DNA含量测定
1.2.1　单细胞悬液样品制备　将石腊包埋标本切取50μm厚的组织5张，二甲苯室温下脱蜡，用100%、95%、70%、50%乙醇和蒸馏水度水化。用胃蛋白酶消化组织。300目不锈钢网过滤，经漂洗，低速离心(500r/min×2min)，除去细胞碎片后，得到单细胞悬液。细胞数大于105/ml。再用溴化乙啶(EB)染色后上机测量。
1.2.2　DNA的FCM分析　用EPICS ELITE型流式细胞仪(Coulter公司)，2W氩离子激光器，波长488mm，输出功率300mW。实验前先用EB染色的鸡红细胞悬液作为较准仪器的标准样品，使变异系数(CV)值小于4%。测量结果用Multycyle软件在计算机上拟出细胞各时相(G0/G1、S和G2M)分布。
1.2.3　DNA倍体性的判断标准与S期细胞比率分组　用DNA指数(DNA Index,DI)表示细胞DNA含量。DI是样品细胞与对照组细胞G0/G1峰均值的比值。以正常腮腺组织细胞DNA含量为二倍体标准(DI=1.0)。二倍体和近二倍体肿瘤细胞DI范围为0.85～1.15。在此范围以外均为异倍体肿瘤。根据全组S期细胞比率(synthesis phase fraction, SPF)的平均值分组，高于平均值者为高SPF。
1.3　AgNOR定量测定
1.3.1　AgNOR染色　将石蜡包埋标本切取4μm组织片，经脱蜡，梯度乙醇水化。用2%明胶甲酸溶液和50%硝酸银溶液按1∶2临用前制成染液。20℃恒温下避光染色40min后，去离子水洗，梯度酒精脱水，二甲本透明，树胶封片。
1.3.2　AgNOR计数　按Crocker推荐方法［6］油镜下于肿瘤细胞密集区随机计数100个肿瘤细胞，其指标如下。(1) 数目：计数每个细胞核内AgNOR颗粒数，求出平均值。(2) 大小：对每个细胞核内AgNOR颗粒用C2型2n网型测微尺(上海第三光学仪器厂)测量其直径，直径大于0.5μm为大颗粒，直径小于或等于0.5μm为小颗粒，记录颗粒大小数，求出平均值。(3) 形态：颗粒分为规则型AgNOR(圆形和近似圆形，边缘光滑)和异形(杆状，多边和奇异形等)。记录每例异形颗粒比例，求出均值。(4) 分布：根据AgNOR颗粒在核内所处的位置，分为中央位(细胞长、短径连线中点)，周边位(紧贴或位于核膜上)和偏中位(中央位与周边位之间)，记录每例周边位与中央位和偏中央位之比，求出均值。

2　结果

2.1　DNA含量
　　无复发组、复发组和恶性组肿瘤异 体率分别为12.1%(4/33)，27.3(3/11)和68.8%(11/16)；高PSF率(最低为4.0%，最高为29.5%，平均17.8%)分别为9.1%、27.3%和87.5%。经χ2检验，异倍体率和高SPF率，无复发与复发组比较P>0.05；恶性与无复发或复发组比较，异倍体P<0.05，高SPF，P<0.01。