摘　要：目的　检测地塞米松诱发NIH小鼠先天性腭裂时对表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法　在GD1212天小时给怀孕小鼠腹腔注射磷酸地塞米松注射液(50mg/kg)，对照组则以等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时取出胎鼠头部标本，作冠状位切片。采用免疫组化方法检测胚胎腭中EGFR的表达。结果　EGFR的表达随胚胎腭的发育而增高，实验组EGFR增高的速度较慢。结论　地塞米松诱发先天性腭裂发病与EGFR表达的改变有关。
　　
　　先天性腭裂是口腔颌面部常见的先天性畸形，发病率高。尽管在临床上对于这种发育畸形的序列治疗已日趋完善，但该病发病机理尚不清楚。
　　胚胎腭的发生发育是一系列连续、复杂的生物学过程，在这一系列复杂的过程中，需要激素、第二信使、生长因子等参与生命活动信号的传递。Brunet等发现［1］，体外培养的腭器官中，125I-EGF的结合位点广泛存在，并随着腭器官的发育而发生时空性改变。Abbott和Shiota曾报道表皮生长因子受体(EGFR)在胚胎腭发育过程不同时期会发生改变［2，3］。这些结果提示EGFR在胚胎腭发育中具有重要作用。本研究采用免疫组化方法检测胚胎腭发育过程中EGFR的表达变化以及地塞米松对其表达的影响，探讨EGFR在小鼠胚胎腭发育及先天性腭裂发病中的作用。
1　材料与方法
1.1　实验材料
　　6～8周龄体重25～30g雌性NIH小鼠60只，随机分为对照组及实验组，每组30只。兔抗小鼠EGFR抗体，Boster公司产品。S-P免疫组化染色试剂盒，Santa公司产品。DAB显色试剂盒，Santa公司产品。
1.2　标本制备
　　经与雄鼠交配后，如发现阴栓，认为雌鼠已受孕，记为GD00天小时(gestation day，GD)。实验组在GD1212天小时腹腔注射磷酸地塞米松(50mg/kg)［4］，对照组以同等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时颈椎脱位处死母鼠，每组各为5只，剖腹取出胎鼠，切取胎鼠头部。标本经4%多聚甲醛固定24h后，序列酒精脱水，石蜡包埋。以麦克尔氏软骨为基准面，作冠状位4～5μm厚连续切片，H-E染色，脱水，封片，光镜观察。
1.3　免疫组化染色
　　用S-P方法进行免疫组化染色，主要步骤如下：切片脱蜡至水，置3%H2O2中浸泡10min以消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清37°C孵育20min以降低非特异性着色。适当稀释的兔抗小鼠EGFR抗体37°C孵育2h，生物素化的二抗作用20min，三抗作用20min，DAB显色3min，苏木素复染。以购自北京中山公司的阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4　图像处理
　　光镜观察染色结果，选取阳性染色切片经电视摄像系统输入HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像细胞测量系统分析，每个时期各选10个视野。
2　结　果
2.1　光镜观察
　　GD1312天小时对照组及实验组胚胎舌体位置较高，腭突位于舌体两侧向下垂直生长。GD1412天小时对照组舌体降至口底，腭突上抬至舌体上方呈水平相对生长，部分腭突相互接触，中间嵴上皮在中线区形成上皮中缝。实验组腭突位于舌体两侧开始上抬。GD1512天小时对照组腭突接触融合，上皮中缝消失，间充质细胞相互连接形成完整的腭器官。实验组腭突在舌体上方呈水平生长，但体积较小，不能在中线区相互接触，腭裂形成(图1)。
2.2　免疫组化染色
　　EGFR着色位于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色。在胚胎腭中主要表达于上皮成份中，间充质中有散在表达(图2)。
2.3　地塞米松对胚胎腭上皮细胞中EGFR表达的影响
　　免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，将其平均光度值记录如附表。
2.4　地塞米松对胚胎腭间充质细胞中EGFR表达的影响
　　结果见附表。免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，取平均光度值记录如图3。
 

图1　实验组GD1512天小时腭突体积较小，形成HC样裂 H-E×33
 

图2　实验组GD1512天小时腭突EGFR表达方式SP×66