摘　要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)对舌癌细胞凋亡的诱导作用，了解新药FM-MTX治疗舌癌的作用机理。方法：选用不同剂量的FM-MTX与人舌鳞癌Tca8113细胞系共同培养。按不同时间收集细胞悬液，并在透射电镜下观察细胞超微结构的变化。结果：细胞经FM-MTX药物处理组，1 h后，透射电镜下即可看到瘤细胞溶酶体大量增生，4 h后瘤细胞胞浆溶酶体开始吞噬磁性微粒，24 h吞噬颗粒明显增多，溶酶体膜开始裂解，颗粒释放到胞浆内。72 h后其内质网及线粒体内也可见颗粒沉积，溶酶体膜有消失现象，呈现胞浆空泡结构。96 h后部分瘤细胞出现凋亡。结论：甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)对舌癌细胞凋亡起诱导作用，进入瘤细胞的细胞器，对肿瘤细胞有明显的杀伤作用。

　　细胞调亡(apoptpsis)是一种

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞系及细胞培养

　　人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞由上海第二医科大学口腔医学院建株，第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室提供。将细胞接种于含体积分数为15%小牛血清的RPMI1640(GIBCO)培养液中、37 ℃ 的体积分数为5% CO₂条件下培养。

　　1.2　FM-MTX进入瘤细胞后内在化过程超微结构观察

　　取生长旺盛的Tca8113细胞消化传代，加RPMI1640培养液，制成细胞悬液，细胞计数调至1×10⁵个/ml。传至中号培养瓶6瓶，培养24 h后，取5瓶，每瓶加入FM-MTX 100 μg/L，继续培养，分别于1 h，4 h，24 h，72 h，96 h收获细胞，离心(1000r/min,5 min)，弃上清，用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)洗3次，弃上清，向细胞沉定内加入体积分数φ为2.5%戊二醛溶液固定1周。10 g/L锇酸后固定2 h，系列乙醇脱水后入丙酮。Epon812环氧树脂包埋。制备成超薄切片，铀-铅双染色，JEM-2000EX透射电镜观察FM-MTX药物颗粒进入瘤细胞的内在化过程。

　　1.3　FM-MTX对细胞周期的影响

　　取对数生长的Tca8113细胞，用2.5 g/L胰酶消化制成10⁵个/ml的细胞悬液，传至中号培养瓶4瓶，继续培养24 h后，其中3瓶中分别加入FM-MTX 1000、100、10 μg/L，另一瓶不加药物作为对照组。在加热后第3 d收获细胞。各瓶细胞分别用2.5g/L胰酶消化5 min，使细胞尽可能分散成单个细胞。移入离心管中。离心(800r/min,5 min)，弃上清，加预冷4 ℃ PBS 10 ml(pH7.4)吹打均匀，待细胞分散良好时，将其吹入预冷4 ℃的φ(乙醇)=70%中固定48 h，在FCM上检测细胞周期变化。对各组细胞大小、DNA含量、细胞周期G₁、S、G₂各期细胞数分布比例进行测定，用Multicycle软件分析并打印细胞周期分布状况^〔3〕。

　　2　结　果

　　2.1　FM-MTX对瘤细胞内在化过程

　　在生长旺盛的Tca8113细胞中加入FM-MTX药物，1 h后，透射电镜下可见瘤细胞内溶酶体大量增生，溶酶体内尚未见到FM颗粒的沉积(图1)。4 h后可见溶酶体内有吞噬的FM超微磁粒；瘤细胞内线粒体肿胀，糖原颗粒增多(图2)。24 h则见溶酶体明显增大，FM颗粒增多(图3)。48 h溶酶体膜裂解，胞浆内可见磁微粒(图4)。72 h粗面内质网及线粒体内均可见有磁微粒沉积，溶酶体膜消失，胞浆呈空泡结构(图5)。96 h出现凋亡细胞，核固缩，可见凋亡小体(图6)。

图1　瘤细胞内溶酶体大量增生(TEM×3K)

图2　溶酶体内有吞噬的FM超微磁粒，线粒体肿胀，糖原颗粒增多(TEM×30K)

图3　溶酶体明显增大，吞噬的FM颗粒增多(TEM×60K)

图4　溶酶体膜裂解，胞浆内可见磁微粒(TEM×60K)

图5　溶酶体膜消失，胞浆呈空泡结构(TEM×30K)