摘　要：目的　建立基因转染兔胸锁乳突肌和确定其最优化方案。方法　采用大规模提纯的pBlacZ质粒制备分子外科注射液，选择与临床密切相关的因素进行基因转染最优化方案的研究。通过手术切开，暴露兔胸锁乳突肌，模拟临床操作，进行分子外科注射术转染外源基因的试验，同时利用正交试验设计分析X-gal染色切片。结果　基因转染实验侧含pBlacZ质粒的肌肉组织有lacZ基因的表达，4周、纵向、200μl可获得最高的基因表达效率。结论　胸锁乳突肌可摄取和表达外源质粒，是一个潜在的分子外科转基因部位。
　　
　　口腔癌多发生颈部淋巴结转移，且较长时间停留在颈部，从解剖上看，粗大的胸锁乳突肌覆盖于颈部主要淋巴结链上，两者关系极其密切［1，2］。因此，癌细胞颈淋巴结转移的基因治疗，可以利用胸锁乳突肌来进行。如在临床上行改良根治性颈淋巴清扫术或选择性颈淋巴清扫术后，可于胸锁乳突肌上多点注射带有目的基因的基因疫苗，诱发机体的抗肿瘤免疫，杀伤残留的癌细胞或扩散到淋巴结被膜外的癌细胞，进一步完善“无瘤操作”程序，提高颈淋巴清扫术的效果，预防术后的转移和复发［3，4］。
　　本实验在制备了分子外科注射液后，通过手术切开暴露兔胸锁乳突肌，研究了lacZ基因(β-半乳糖苷酶基因)的表达及确定了最优化方案，为进一步的实验奠定了基础。

1　材料与方法

1.1　质粒pBlacZ大规模提取纯化鉴定
　　将含有重组质粒pBlacZ的大肠杆菌JM101的单菌落接种入200ml LB培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，依次加入溶液Ⅰ(15%蔗糖，25mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,pH=8.0)，溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,10%SDS)，溶液Ⅲ(3mol/L NaAc)，加入0.6倍体积的异******，用苯酚∶氯仿∶异戍醇(25∶24∶1)抽提2次，将DNA溶于100μlTE缓冲液中，-20°C。贮存用紫外分光光度法检测质粒DNA纯度及浓度，琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA分子质量大小。
1.2　制备分子外科注射液
　　将提纯的pBlacZ质粒(OD260/OD280在1.8～2.0之间)配成1μg/μl溶于PBS缓冲液中(含5%蔗糖，pH=7.4)。
1.3　制备实验动物模型
　　实验动物为出生5个月的日本大耳白兔共16只(由湖北医科大学实验动物中心提供)。采用3%戍巴比妥钠从耳缘静脉按1.0mg/kg注射麻醉大白兔，术中可酌情追加麻醉。
1.4　兔胸锁乳突肌上下对照和正交试验设计方案
　　正交试验设计包括3个因素和2个水平并按L827正交表执行。

　　同时在胸锁乳突肌的上段设立对照组，下段设立实验组。
1.4　动物试验手术步骤
　　静脉麻醉大白兔后，手术区部位消毒，用10号手术刀切开大白兔颈部皮肤和皮下组织，分离暴露胸锁乳突肌，小心勿损伤胸锁乳突肌，完善止血，在胸锁乳突肌上相距约2cm远处分别打一外科结作为标记，上方为对照组，下方为实验组，按正交表试验设计安排，分别沿胸锁乳突肌注射分子外科注射液，术后清理手术野，分层对位缝合皮下肌层和皮肤，手术切口处涂抹红汞，腹腔注射庆大霉素和地塞米松预防术后感染，术后严密观察大白兔伤口情况和一般状况，加强抗炎处理。
1.5　lacZ基因表达产物在兔胸锁乳突肌中表达的检测
　　根据正交表试验设计安排，分别在第1周或第4周处死大白兔各8只，按标记切取所需的一段胸锁乳突肌，立即送往病理室作快速冰冻切片，冰冻切片以1.25%戍二醛固定10min，吹干，注意勿使冰冻切片之间相互贴附，冰冻切片置X-gal染色液中于37°C温育染色48h，各级酒精脱水，二甲苯透明、树脂封片，镜下观察并拍照。
2　结果

2.1　兔胸锁乳突肌上下对照试验
　　对照组：不含pBlacZ质粒的肌肉经X-gal染色后不出现蓝绿色。试验组：含pBlacZ质粒的肌肉经X-gal染色后出现蓝绿色。见图1，2。试验组的标本的蓝染率见图3。