〔摘要〕　目的：利用成骨细胞体外培养条件下向生物材料表面移行、贴附和 方向性排列的特性，建立骨内种植材料—人胚成骨细胞培养的三维实验模型。方法：将钛片放入长满的人胚成骨细胞层表面，给予钙化条件，即DMEM培 养液中加体积分数为10%胎牛血清、50 mg/LL-抗坏血酸、10 nmol/L地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸钠。结果:活细胞跟踪观察揭示钛片放入细胞层表面后 即有细胞自细胞层表面向钛片侧壁移行、贴附，并在二者之间形成细胞桥。随着培养时间的 延长，移行贴附的细胞逐渐增多，在钛片侧壁与成骨细胞之间的界面处形成复层细胞层，进 而建立起生物材料—成骨细胞体外培养的三维实验模型。相差显微镜下复层细胞表现为折光 带，这反映生物材料引导细胞贴附并保持细胞贴附的能力。界面的组织学观察则揭示出生物 材料与细胞之间的界面关系。结论:这模型是一种理想的体外研究种 植体骨界面的研究方法。

　　种植体骨界面的早期愈合过程，是决定种植体成功与否的关键性阶段，主要表现为细胞 的行为变化〔1〕，具体包括未分化间充质细胞、骨母细胞以及成骨细胞在种植体的 影响下自周围松质骨内膜向其表面移行、贴附，同时细胞出现增殖、分化、合成并分泌骨基 质。目前所采用的骨内种植材料体外实验模型及评价指标，基本上为一维实验模型。它撇开 了细胞在体内的三维空间因素，直接研究成骨细胞的自身反应，揭示细胞的生长特征、分化 程度及功能状态，使研究具体化、简单化。但对种植材料影响界面骨愈合机制的认识却仅仅 局限在细胞的一维水平〔2，3〕。然而，在界面愈合过程中，成骨细胞始终处于由细 胞外基质构成的三维立体结构之中，体内细胞的各种生物学表现均是在这种特定的生活环境 下实现的。因此，建立生物材料-成骨细胞体外培养的三维实验模型非常必要。在此基础上 ，可以深入细致地研究成骨细胞在骨愈合过程中的行为特点、影响因素以及种植体-成骨细 胞的界面关系。可目前尚未见此类三维实验模型的明确提出和实验报道。本实验将利用成骨 细胞体外培养条件下的生物学特性，建立生物材料-成骨细胞界面相互作用的体外三维实验 模型。

　　1　材料与方法

　　1.1　钛片制备

　　切取直径2.5 mm、厚1.0 mm的纯钛片（TA2），中央有一直径为1.0 mm之孔洞钛片周磨光 ，至晶相砂纸800目，清洗、钝化、消毒，备用。

　　1.2　成骨细胞培养

　　采用组织块法原代分离培养人胚成骨细胞，经权威的鉴定方法鉴定证实〔4〕。细胞 传至第10代长满后，2.5 g/L胰酶消化，制取细胞悬液（2×104个/ml），接种6孔培养板 内（3 ml/孔）。DMEM培养液含体积分数为10％胎牛血清、10 mol/L地塞米松、50 mg/L L- 抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠，37 ℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培 养(图1)。至第7 天，成骨细胞已铺满培养板，形成均匀的细胞层。

　　1.3　放入钛 片

　　在已长满人胚成骨细胞的6孔培养板内小心放入直径2.5 mm的钛片,每个钛片相距1 cm，换新 鲜培养液。以后每3 天换培养液一次，每次换液时，注意防止移动钛片。自放入钛片起开始 计算培养时间，培养时间为1个月。

　　1.4倒置显微镜观察

　　1.5组织切片观察

　　培养1个月后，细胞及钛片原位固定、脱水、Epon812包埋，分切包埋块，经液氮冷冻断裂法 将钛片侧壁表面的细胞完整转移至包埋块内，以水平方向进行二次包埋，超薄切片机切取细 胞厚片（厚度1.0 μm），以美兰—碱性复红染色，光学显微镜观察。

　　1.6　细胞界面的透射电镜观察

　　细胞培养及切片制作同方法1.5，但固定与染色按常规透射电镜标本的制作方法进行。

　　2　结　果

　　2.1　活细胞跟踪观察

　　放入钛片后第1天，已有散在的细胞自细胞层向钛片周边移行，并与侧壁表面贴附，形成细 胞复层，在钛片与细胞层之间可见细胞桥。细胞桥与钛片周边垂直或成一定的锐角，而移至 钛片侧壁表面的细胞则与表面周边平行贴附。第3天，相差显微镜下移行细胞呈现为折光带 ，分布于钛片周围。折光带相互连接，几乎占据整个钛片周边（图2）。高倍镜下见钛片— 成骨细胞界面处细胞与钛片侧壁紧密贴附，折光带区的移行细胞排列规则，平行于钛表面。第7天，钛片周围的折光带进一步扩大，增宽，且亮度增强。高倍镜下所见同培养第3 天。第14 天，折光带高倍镜下见细胞间出现少量颗粒状物质，散在分布。培养至1个月，细胞间 颗粒连接成片，分布于整个钛片周边移行细胞区，肉眼见呈白色，不透光。