摘　要：目的:研究低血清培养条件下转化生长因子-β（TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、碱性成纤维生长因子（bFGF)对人髁突软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原基因表达的调控作用。方法:采用体外细胞培养及mRNA狭缝杂交的方法。结果:IGF-Ⅰ对3种前胶原的mRNA水平无显著影响。bFGF、TGF-β均呈不同程度地抑制Ⅱ型胶原的基因表达,分别为对照组的0.352及0.658倍，同时TGF-β显著增加了Ⅰ型胶原的基因表达。结论:IGF-Ⅰ具有稳定软骨细胞表型的作用，bFGF、TGF-β可抑制软骨细胞终末分化。

　　胶原蛋白是关节软骨重要的细胞外基质成分，占软骨干重的60%～80％。胶原纤

维相互交联形成网状支架，从而赋于软骨特有的组织形态。胶原的种类、含量及其空间排列方式，决定着关节软骨的生物力学特性和功能状态。骨关节病（osteoarthrosis，OA）及关节损伤早期，关节软骨都表现为增殖旺盛，但最终以软骨进行性破坏、骨赘形成或为纤维结缔组织所取代。最近的研究表明，在病变关节软骨中出现了除软骨特异性的Ⅱ型胶原以外的Ⅰ、Ⅲ型的胶原^［1,2］。因而有学者提出病变软骨细胞的表型基因异常是软骨损伤及OA修复失败的直接原因，并指出调控软骨细胞表型在OA及关节软骨损伤治疗中的可行性^［3］。本研究旨在探讨转化生长因子-β（TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、碱性成纤维生长因子（bFGF)对几种重要的间质型胶原即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达的调控作用,以期为骨关节病及软骨损伤的异常修复发生机理及筛选并合理应用生长因子治疗OA及关节损伤的可行性提供理论基础和实验依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　bFGF、 TGF-β、 IGF-Ⅰ、 DMEM培养基（GIBCO BRL，USA）,含Ⅰ、Ⅱ型胶原cDNA片段质粒,含Ⅲ型胶原及β-Actin cDNA片段的质粒,细胞总RNA分离纯化试剂盒及低熔点琼脂糖（Gene Co Ltd．USA）,限制性内切酶EcoR I，Hind Ⅲ（Gibco USA）,地高辛标记检测试剂盒及尼龙膜（Boehringer Mannheim,Germany），其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

　　1.2　方法

　　1.2.1　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原cDNA探针的提取、标记 各型重组质粒经转化、鉴定后，大量扩增，经碱裂解法抽提质粒，限制性酶切消化后低熔点琼脂糖凝胶电泳回收特定cDNA片段。探针标记按地高辛标记试剂盒说明进行。

　　1.2.2　人髁突软骨细胞培养及实验分组 取培养第二代人髁突软骨细胞，以1×10⁵/ml密度接种于125 ml培养瓶。DMEM培养基中加入20％的小牛血清。于37℃、5％ CO₂浓度、饱和湿度下培养，隔日换液，待细胞长满汇合成单层时（约为2×10⁶）。更换培养基（含0.4%小牛血清），分别加入不同的实验因素。实验分组如下：空白对照组，TGF-β（5 ng／ml）组，IGF-Ⅰ（10 ng／ml）组，bFGF（50 ng／ml）组。每5瓶细胞为一组，继续培养24 h。终止培养，提取各样品的总RNA。

　　1.2.3　人髁突软骨细胞RNA的提取、鉴定 采用RNeasy试剂盒提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定OD₂₆₀OD₂₈₀值，以确定RNA的纯度和含量，大于1.8表明纯度较好。经甲醛变性凝胶电泳鉴定，28 S及18 S条带清晰，所获RNA具较好完整性。

　　1.2.4　狭缝杂交及密度扫描 取适当大小的尼龙膜，取各RNA样本，依次等倍稀释，即4、2、1 μg，上样抽滤。置120℃真空烤箱内30 min,使样品RNA与尼龙膜发生交联。将点样的尼龙膜放入塑料袋中，加入预杂交液(7％SDS，50 mmol/L磷酸钠pH7.0，50％甲酰胺，2％封闭剂，5×SSC，0.1％月桂酰肌氨酸钠，50 μg／ml酵母总RNA）4 ml，50℃水浴保温2 h。更换杂交液（含50 pg/ml已变性的特定cDNA探针），50℃恒温杂交过夜。杂交后，以2×SSC，0.1%SDS；0.1×SSC，0.1％ SDS依次洗膜。在抗地高辛抗体（150 mu／ml）溶液中孵育30 min，将杂交膜转移至3 ml显色液中，暗室内室温孵育16 h。马来酸缓冲液中终止反应。待尼龙膜干燥后，进行灰度扫描，自动记录结果。