全自动图像分析仪定量测定分析各组新生骨组织酶活性,根据ALP和ACP染色深浅即图像的灰度(grey level)在镜下(×56倍)定强阳性和阳性阈值,以便在各自统一标准下进行比较(表1)。
各组不同时间的骨组织ALP和ACP活性见表2、3。
表1 ALP和ACP染色图像灰度分级的阈值
| 酶染色 | 强阳性 | 阳性 |
| ALP | 0～30 | 31～80 |
| ACP | 0～40 | 41～80 |
表2 各组不同时间骨组织的ALP活性
| 组别 | 时间(月) | 强阳性(%)
|
阳性(%)
|
| 对照组 | 1 | 6.12±2.30 | 10.92±2.13 |
| 2 | 8.33±2.21 | 24.85±5.36 | |
| 6 | 3.08±3.23 | 8.16±5.65 | |
| 卵巢切除术 | 1 | 3.02±1.41* | 9.47±5.19 |
| 2 | 3.53±1.72** | 16.03±4.43* | |
| 6 | 1.33±0.39* | 5.19±1.17* | |
| 糖尿病组 | 1 | 2.56±0.87** | 5.33±1.22* |
| 2 | 3.30±1.02** | 6.78±1.29** | |
| 6 | 0.41±0.14** | 1.18±0.83** | |
| 甲状腺组 | 1 | 1.43±0.40** | 8.52±1.37 |
| 2 | 1.53±0.61** | 3.16±0.78** | |
| 6 | 0.49±0.25** | 0.70±0.32** |
n=6, * 与对照组比较P＜0.05,** 与对照组比较P＜0.01
表3 各组不同时间骨组织的ACP活性
| 组别 | 时间(月) | 强阳性(%)
|
阳性(%)
|
| 对照组 | 1 | 8.06±4.22 | 13.53±5.73 |
| 2 | 13.97±5.06 | 22.24±2.21 | |
| 6 | 5.63±1.87 | 14.04±4.90 | |
| 卵巢切除术 | 1 | 6.02±1.62 | 12.26±1.53 |
| 2 | 8.01±2.04* | 12.47±4.01** | |
| 6 | 8.54±3.24 | 13.88±4.36 | |
| 糖尿病组 | 1 | 6.88±6.39 | 8.44±5.23 |
| 2 | 0.96±0.40** | 12.91±3.94** | |
| 6 | 4.09±1.65 | 13.98±10.25 | |
| 甲状腺组 | 1 | 0.78±0.75** | 13.36±7.65 |
| 2 | 0.17±0.06** | 4.53±1.15** | |
| 6 | 4.08±3.07 | 23.03±14.30** |
n=6, * 与对照组比较P＜0.05,** 与对照组比较P＜0.01
3 讨 论
本实验采用偶氮色素法进行ALP和ACP染色,利用特异的底物,被细胞的ALP或ACP水解,然后与捕获剂偶合,形成有色沉淀,来显示酶在组织中的定位。图像分析系统能客观、精细地用数字表达存在于标本图像上的各种信息。本研究将三种内分泌因素影响下新生牙槽骨的ALP和ACP改变,通过该系统将不规整的酶活性变化转化为量化信息,更客观地分析比较这些成分在细胞中的动态变化,进而阐明其功能。
在骨修复重建过程中,成骨细胞、破骨细胞和骨细胞的活动相互关联,一定条件下可相互转化。本实验观察到新骨形成处ALP强阳性反应的成骨细胞显著增加,ALP为成骨细胞的标记酶［7］,主要位于细胞膜、粗面内质网和线粒体等处,可作用于有机磷酸复合物,使组织中局部磷酸根增多,导致钙盐沉积,参与骨基质形成和矿化,使骨小梁结构增粗。成骨活跃处,同时可见破骨细胞活动,破骨细胞的溶酶体、高尔基体和胞内空泡中含大量ACP,使骨基质的有机成分解聚,吞噬分解骨基质碎片,最终可将最初形成的不成熟的原始骨组织改建为成熟骨组织［8］。
牙槽骨吸收修复与全身健康状况及全身系统性疾病相关［9］。本实验结果显示,在人工二壁骨袋术后,ALP和ACP活性在1、2个月阶段较高,6个月后降低,和骨修复改建在1、2个月较活跃一致;提高甲状腺素水平组ALP与ACP活性普遍较对照组低,有统计学差别(P＜0.01),骨质形成减少,其6个月组ACP阳性值较对照组高(P＜0.01),可能系该组动物连续服甲状腺素6个月,甲亢症状严重,此时ACP活性强,表明骨吸收作用强,与组织学观察到的骨质形成少,局部被含大量破骨细胞的纤维结缔组织代替相吻合［10］;而在诱发实验性糖尿病组和手术切除卵巢组,仅ALP降低有显著差异(P＜0.05或P＜0.01),而ACP仅2个月组有显著性降低,说明此时成骨作用较正常组明显减弱,骨形成减弱多,骨吸收减弱较少,造成骨修复成熟较慢。以上资料说明牙槽骨的修复重建是在全身因素的调控下,成骨细胞与破骨细胞协同作用的结果,也即ALP和ACP协同作用的结果。这些资料对评估牙槽骨的修复重建和吸收破坏机制具有理论和实用价值。
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