摘　要：目的:明确内分泌因素对牙槽骨修复过程中碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响,并探讨牙槽骨吸收修复机制。方法:24只狗的牙槽骨二壁骨袋模型,随机分成4组,采用组织学检查、酶组织化学和全自动图像分析等技术定量分析去除卵巢、诱发实验性糖尿病及提高甲状腺素水平情况下,骨缺损修复过程中ALP和ACP活性变化。结果:甲状腺素组除6个月组ACP活性较高外,ALP与ACP活性均较对照组低,有统计学差异(P＜0.01);糖尿病组和卵巢切除组仅ALP降低有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01),酶的活性与骨形态结构变化相吻合。结论:牙槽骨修复受全身内分泌因素的调控,且与其破骨细胞和成骨细胞的酶活性密切相关。

s=tt1 align=left>　　牙槽骨吸收是牙周病进展期的重要特性,目前对牙槽骨破坏修复的认识多数来自体外实验^［1～3］,而骨修复过程中全身因素对细胞中酶、细胞结构及功能的影响研究较少。本研究对狗二壁骨缺损的动物模型采用组织学观察、酶细胞化学和全自动图像分析等技术,定量分析去除卵巢、实验诱发性糖尿病及提高甲状腺素水平情况下,骨缺损修复过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性的动态变化。

　　1　材料和方法

　　1.1　二壁骨缺损动物模型制备

　　成年杂种狗24只,体重8～12 kg,全麻下在上颌尖磨牙区牙间隙处,翻开全厚粘骨膜瓣,制备颊舌向2～2.5 mm、近远中向3～4 mm(以牙间隙长度为限)、深4～5 mm的二壁骨缺损,在远中牙面作刻痕标记深度。

　　1.2　实验分组和取材部位

　　24只狗在制备人工二壁骨袋后,根据实验要求随机分成4组,每组6只(除卵巢切除组为雌性外,其余组雌雄不定):①卵巢切除组:手术切除两侧卵巢;②糖尿病组:腹腔注射链脲佐菌素60 mg/kg^［4］;③甲状腺素组:每日喂服左旋甲状腺素100 μg 1～6月;④对照组:不作其它处理。各组于1、2、6月分别处死2只狗,用细锯和锐利的单面金钢钻刀片截取骨袋部位修复骨作组织学观察和酶组织化学研究。

　　1.3　碱性和酸性磷酸酶染色

　　1.3.1　固定和脱钙 将骨缺损修复部位宽约10 mm、长10 mm、厚1.5 mm的组织块,用4%多聚甲醛和0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH7.2)在4℃条件下固定3 h。然后用4%EDTA-2Na溶液(pH7.2)在4℃条件下脱钙10 d,每天换1次脱钙液,每天振荡3次,每次10 min。

　　1.3.2　冰冻切片染色 每个组织块在-18℃条件下连续切片6张,厚约5 μm,HE、ALP及ACP染色各为2张,采用偶氮色素法进行ALP和ACP染色^［5，6］,ALP呈紫色,ACP呈桔红色(试剂由上海虹桥医用试剂实验研究所生产)。

　　1.3.3　组织学观察和图像分析 分别于1、2、6个月进行组织学观察,使用OMSP-30型显微分光光度计(OPTON公司),各选6个视野,在摄像机上得到适当放大的图像,输入VIDAS多功能图像分析仪(德国ZEISS公司),将酶染色深浅程度(即图像的灰度)定阈分为强阳性和阳性2级,自动进行分级。测量出标本中不规整的酶染色面积,自动地转变为量化信息,算出百分比,用分组t检验分析结果。

　　2　结　果

　　2.1　镜下观察

　　各组1～6个月均有不同量新骨形成,新骨与旧骨间可见较明显的分界线,新生的骨小梁细小,常呈网络状,髓腔大,血管较丰富,小梁壁上有单层或双层栅栏状排列的成骨细胞(图1)。酶组织化学染色显示:旧骨部位ALP和ACP染色均弱,偶见ALP阳性的成骨细胞或ACP阳性的破骨细胞,在骨髓腔有时可见少量ALP或ACP反应颗粒;新生骨小梁边缘多见栅栏状排列的ALP阳性染色的成骨细胞(图2),骨陷窝内的破骨细胞体积大,ACP常呈强阳性、深红色染色斑块充满细胞,有时甚至掩盖核染色(图3);未分化细胞未见染色。

图1 新骨和旧骨交界处 HE ×140

图2 新生骨小梁壁上栅状排列的成骨细胞(OB)

　　ALP染色 ×600

图3 骨陷窝处的破骨细胞(OC) ALP染色 ×1400

　　2.2　图像分析和统计结果