摘要　目的:观察体外培养及传代对人髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法:采用体外细胞培养、免疫生化及分子生物学方法观察传代过程中人髁突软骨细胞形态、Ⅱ型胶原及蛋白多糖合成及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原的mRNA水平变化。结果:传代过程中人髁突软骨细胞Ⅱ型胶原合成及其mRNA水平逐渐降低，至第7代已基本丧失。而Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA水平随传代逐渐升高，同时伴有细胞蛋白多糖合成的减少，细胞壁形态由圆形或多角形转变为长梭形占优势。结论:体外培养及反复传代可影响软骨细胞的表型特征。髁突软骨细胞的反分化标准应从胶原、蛋白多糖合成及细胞形态等方面综合评价。

　　软骨细胞的

　　1　材料和方法

　　1.1　材料和试剂

　　Ⅱ型胶原酶(Sigma,USA),DMEM培养基(Gibco，USA),小牛血清(华西医科大学分子生物学实验室),Ⅱ型胶原单克隆抗体(Oncogene Research Products，USA)，含Ⅰ、Ⅱ型胶原cDNA片段质粒(北京医科大学运动医学研究所曲绵域教授惠赠),含Ⅲ型胶原及β-Actin cDNA片段的质粒(华西医科大学章锦才教授惠赠),细胞总RNA分离纯化试剂盒及低熔点琼脂糖（Gene Co Ltd，USA），限制性内切酶EcoR I，Hind Ⅲ（Gibco，USA），地高辛标记检测试剂盒及尼龙膜（Boehringer Mannheim，Germany），其它试剂均为国产分析纯。

　　1.2　髁突软骨细胞的分离、培养、传代

　　参照文献^［2］方法，下颌骨髁突软骨取自因健康原因需终止妊娠的4～6月水囊引产人胚胎，经机械分离及胰蛋白酶、胶原酶消化，获得高成活率、均一的软骨细胞。接种于含10％小牛血清的DMEM培养基（青霉素100 u／ml，链霉素100 μg／ml，抗坏血酸50 μg／ml），于 CO₂孵箱内，37℃，5％CO₂饱和湿度下培养。待细胞长满汇合成单层后开始传代，本实验传代7次。

　　1.3　髁突软骨细胞形态学观察

　　在原代及传代培养过程中定期进行相差显微镜观察及摄影。

　　1.4　生长曲线绘制

　　将不同传代髁突软骨细胞按2×10⁴／孔接种于24孔板。从接种后第1天起，随机取孔，以0.25％胰蛋白酶消化后记数，取均数描记生长曲线。

　　1.5　甲苯胺蓝染色

　　培养软骨细胞甲苯胺蓝染色参照Takigawa等人^［3］的方法。

　　1.6　培养软骨细胞合成Ⅱ型胶原的免疫检测

　　取不同传代软骨细胞1瓶（25 ml培养瓶）。用0.25％胰蛋白酶消化获得细胞，用PBS洗涤两次，离心弃上清，加入1×SDS样品缓冲液（50 mmol／L Tris.cl pH 6.8，100 mmol/L二硫苏糖醇，2％SDS，10％甘油）充分混匀，置100 ℃煮沸10 min，移入冰浴，离心取上清，-20 ℃保存备用。

　　分别取各传代细胞提取物4 μl点样于硝酸纤维素膜上，平行点样不同稀释浓度的成骨细胞（Mc-3T3E₁）提取物，室温干燥后装入塑料袋，加入5 ml封闭液（5％脱脂奶粉，0.02％叠氮钠，0.05％吐温-20的PBS），封袋，4 ℃过夜。PBS洗膜后，将膜封于含Ⅱ型胶原单克隆抗体的（1∶20稀释）封闭剂，4 ℃振荡下孵育2 h。再次洗膜后，将膜封于含辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG的封闭液中。封袋后，室温振荡孵育2 h。室温洗膜10 min。最后将膜置于显色液（4-氯奈酚10 mg，甲醇3 ml，10 mmol／L pH 7.6 Tris.cl 17ml，3％双氧水15 μl）显色30 min，照相记录。

　　1.7　培养软骨细胞pro α₁（Ⅰ）、α₁（Ⅱ）、α₁（Ⅲ）基因表达的检测

　　含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原cDNA片段重组质粒经转化、鉴定后，大量扩增，经碱裂解法抽提，限制性酶切消化后低熔点琼脂糖凝胶电泳回收特定cDNA片段。探针标记按地高辛标记试剂盒说明进行。取不同传代次数的髁突软骨细胞(2×10